血清抗ⅱ型胶原蛋白抗体检测法的建立与应用

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1、维普资讯http://www.cqvip.com176临床检验杂志2008年第26卷第3期ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience，2008，Vo1．26，No．3文章编号：1【)()1—764x(2008)03-0176-03中图分类号：R446．6文献标识码：A·实验研究·血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体检测法的建立与应用姜旭淦，陈盛霞，吴琴，汤俊民，马建芬，储青，吴亮，颜小云，刘获，姚加平，许化溪(1．江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212001；2．宜兴市人民医院，江苏宜兴214200；3．灌云县人民医院检验科，江苏灌云222000)摘要：目的建

2、立血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的ELISA法，探讨其在类风湿关节炎(RA)患者中的应用价值。方法以自提可溶性鸡Ⅱ型胶原蛋白(solublechickencollagentypeⅡ，SCC1I)作为包被抗原，优化实验条件，建立抗Ⅱ型胶原蛋白抗体间接ELISA法。对124例RA病人和54例健康人血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体进行检测。结果血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的检测条件为：SCCⅡ包被浓度为20rnl；以含10％羊血清的缓冲液进行封闭、稀释血清和酶标抗体；采用双波长(450nm／630nrf1)进行测定。RA患者和健康人血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体阳性率分别为l9．35％(24／124)和1．85％(1／54)，两组

3、有明显的统计学差异(P<0、01)。结论以SCC1I为包被抗原检测抗Ⅱ型胶原蛋白抗体可作为判断RA患者病情的一个辅助诊断指标。关键词：类风湿关节炎；酶联免疫吸附实验；1I型胶原蛋白；抗Ⅱ型胶原蛋白抗体人关节软骨中含有不同类型的胶原蛋白，其中治的RA患者，均符合1987年美国风湿病协会的Ⅱ型胶原蛋白(collagentypeII，CII)含量最为丰RA诊断标准，其中男性49例，女性75例；年龄19富。近年来研究表明，类风湿关节炎(rheumatoid～75岁，平均48岁。健康对照54例为查体健康arthritis，RA)的发病与CII自身免疫反应有关，不仅者，其中男性20例，女性34例；年龄21

4、～72岁，平在RA患者血清和关节部位存在抗C1I抗体，而且均47岁。均采集晨起空腹静脉血，1800r／min离胶原诱导性关节炎模型中将抗CII抗体给动物输注心分离血清，～20clC保存待检。可产生或有助于产生关节炎。目前，血清抗C11．5血清抗C1抗体检测法的建立与条件优化抗体检测多采用酶联免疫吸附试验(enzymelinked1，5．1抗CII抗体的检测方法将新鲜羊血清60immunosorbentassay，ELISA)，但结果相差很大J。clC20min灭活，加入适量Tris(终浓度0，05mol／L)本研究在提取纯化可溶性鸡Ⅱ型胶原蛋白(soluble和NaC1(终浓度0．15mol／

5、L)，用2mol／LHC1调pHchickencollagentypeII，SCCII)的基础上，优化实至8．0，一20clC保存备用。待测标本用含10％羊血验条件，建立了血清抗CII抗体ELISA测定方法，并清TBS稀释液稀释后，加入反应孔中，37clC2h；酶对124例RA病人和54例健康人血清抗CII抗体进标抗体用含10％羊血清TBS．T稀释液稀释后，加入行了检测，获得了满意结果。反应孔中，37clC1h。显色底物为TMB-HO，以21材料和方法mol／LH：SO终止反应。在酶联仪上测定待检各孔1．1主要试剂胃蛋白酶(Amersco分装，武汉博吸光度(A)值，以测定孔值与阴性对照平均值士

6、德生物工程有限公司)；HRP羊抗人IgG(HRP—的比值大于2．1者为阳性。IgG，Sigma—AldrichInc．)；四甲基联苯胺(TMB·1．5．2抗C11抗体的检测条件优化采用棋盘格2HC1，上海华美生物工程公司)。法对实验条件进行优化。1．2主要仪器电泳仪(Bio-Rad公司)；GeneGen-1．6结果统计分析使用Stata7．0统计学软件，ius全自动图像分析系统(澳大利亚)；SuperT21冷x检验分析RA患者及健康对照者抗体阳性率的统冻离心机(美国)；~Quant紫外可见扫描酶联仪(美计学差异。国，Bio-Tek仪器公司)。2结果1．3SCC1的提取与纯化以鸡胸箭突软骨为原2

7、．1ELISA法检测血清抗CII抗体的最适条件料，用盐酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶消化、氯化钠2．1．1包被采用pH9．6碳酸盐缓冲液和pH7．6盐析等步骤进行SCCII的提取与纯化。磷酸盐缓冲液包被时，实验结果基本一致。SCC1I1．4标本来源124名RA病人来自门诊及病房诊储存液浓度为0．25～0．5g／L，包被浓度为10～20基金项目：江苏省高校自然科学指导性计划项目(06KJD310036)