生物活性胶原蛋白及明胶形态的表征研究

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1、离子交换与吸附，2010，26(1)：53—5810NEXCHANGEANDADS0R10N文章编号：1001—5493(2010)01—0053-06生物活性胶原蛋白及明胶形态的表征研究齐晓玲李贺先王国昌料胡月晗左仁贵功能高分子材料教育部重点实验室，南开大学高分子化学研究所，天津300071摘要：采用弱酸处理法，从新鲜牛皮中提取了胶原蛋白，通过与明胶对比，采用CD、AFM、FrIR和荧光方法对其结构形态进行了表征研究。结果表明，所提取胶原蛋白保持了固有的生物活性，具有典型的旺-螺旋结构。首次建立了稳态荧光的表征方法，不仅与其他方法具有重要互补性，而且具有准确、灵敏、快捷的特点，是

2、表征、研究胶原蛋白及其变性，复性行为的有效手段。关键词：胶原蛋白；明胶；结构形态；稳态荧光中图分类号：0629．7文献标识码：A1前言胶原蛋白是一种由动物细胞合成的生物高分子，对于机体具有十分重要的意义【1】。明胶是胶原蛋白的典型变性形态。胶原蛋白和明胶已被广泛地用作生物高分子材料和医用材料，它被称为是“一个值得永远研究且具有多用途的生物高分子材料”L5J。胶原蛋白结构、生物活性等性能的表征，特别是对反映胶原蛋白微观结构形态的表征已成为研究重点。为此，建立准确、灵敏、快捷的表征方法对胶原蛋白及明胶的基础和应用研究具有重要意义。胶原蛋白具有生物活性的重要标志是其多肽链中0【。螺旋结构

3、含量在50％以上，其在溶液中的主要表征手段有红外光谱和圆二色光谱。红外光谱信噪比较差J。圆二色光谱是表征其化学结构信息，特别是对指纹特征信号弱样品表征的一种较成熟方法，但测量过程耗时较长，参考蛋白质数量和种类的不同，以及计算拟合方法的不同，所得结果常有偏差【7J。本文首次提出利用胶原蛋白中0．3％酪氨酸残基荧光性质，研究胶原蛋白和明胶多肽高分子链聚集形态，并与其他常规表征方法相比较，给出胶原蛋白变性前后其荧光特征光谱。{收稿日期：2009年2月l0日项目基金：国家自然科学基金(20774053，20974056)；天津市自然科学基金(03380261)作者简介：齐晓玲(1981~)

4、，女，黑龙江省人，硕士研究生．}通信联络人Email：gcwang@nankai．edu．cn·54·IonExchangeandAdsorption2010年2月2实验部分2．1试剂及测试仪器试剂：氯化钾(AR)，磷酸氢二钠(AR)，磷酸氢二钾(AR)，柠檬酸钠(AR)，氯化钠(AR)；明胶是牛皮胶原蛋白(I型)水解产物(Aldrich)。试验仪器：UV762紫外可见吸收光谱仪；PhilipsTECNAIG2F-20TEM透射电镜；Bio—RadFTS135傅立叶红外光谱仪；SPEXFL212荧光谱仪；J-810圆二色光谱仪；Nanoscope(R)IIla，DigitalIns

5、trument原子力显微镜。2．2胶原蛋白提取步骤根据文献[8]，取新鲜腹部牛皮，经去肉、脱毛后，研磨至最细小的状态(约200g)，先后用10％NaC1溶液洗涤牛皮8次，0．067mol／L的Na2HPO4溶液洗涤牛皮5次，0．15mol／L、pH为3．7的柠檬酸钠溶液洗涤4次，保留上清液。之后，在上清液中加固体KC1至0．6mol／L，加Na2HPO4至pH为5．8。离心后固体为胶原蛋白粗品。最后将固体用0．2mol／L醋酸溶液溶解、离心，除去固体残余物，用l％NaC1溶液透析上清液、离心，得到胶原蛋白固体，低温保存。2_3样品的制备与表征2-3．1样品制备室温下(25℃)将0．

6、001g明胶溶于lOOmL去离子水，即可制得浓度为1．OxlOg／mL的明胶溶液；取一定量配好明胶溶液在60℃下退火20d，可得到退火明胶溶液。童2．3．2胶原蛋白溶液浓度表征选用浓度为0．5mg／mL的牛血清蛋白(BSA)0做标准溶液，配置系列浓度的溶液，制作出标准曲线(见图1，相关系数0．9971)。取胶原蛋白少量于去离子水中，充分溶解2d，超声、离心，取上ProteinContent(；)清液。然后根据考马斯亮蓝G．250方法测得其饱和溶液浓度[9】。通过计算，测得胶原蛋白饱和溶液图1胶原蛋白的紫外标定曲线的浓度为4．3xlO—g／mL，并用稀释法制备浓度为1．OxlOg／m

7、L胶原蛋白溶液。将配置好的3种溶液在低温下(8"C)保存，以保持其构象稳定。第26卷第1期离子交换与吸附2．3_3红外衰减全反射表征将2_3．1中制得的3种溶液与KBr固体混合，常温下静置，待水挥发干后刮下粉末再进行红外衰减全反射测试。2．3．4圆二色谱表征将2．3．1L}J的3种溶液在室温下(25℃1进行测试，将测试结果进行杨氏模拟计算。2_3．5荧光光谱表征将2-3．】中的3种溶液在室温下f25℃1进行荧光测试，测试中选取激发波长280nm。3结果与讨论3．1胶原