理性设计提高低温α-淀粉酶稳定性的研究

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1、全日制硕士专业学位（毕业）论文理性设计提高低温α-淀粉酶稳定性的研究学位申请人：闫亚茹指导教师：田健学位名称：工程硕士研究领域：食品工程授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月二日分类号：TS218单位代码：100860密级：公开学号：201590705220理性设计提高低温α-淀粉酶稳定性的研究Improvementofthestabilityofcold-adaptionα-amylasethroughrationaldesign学位申请人：闫亚茹指导教师：田健学位名称：工程硕士研究领域：食品工程授予单位：河

2、北农业大学答辩日期：二〇一八年六月二日摘要与中温和高温淀粉酶相比，低温淀粉酶在低温环境下有较高的催化活力，这一特性赋予了低温淀粉酶极大的应用潜力。因为在低温环境下进行催化反应易于保持食品的营养价值和风味，而且还可以节约能源和减少环境污染等。然而来源于自然界的野生型低温淀粉酶大部分稳定性都不好，这一特性限制了其在工业中的生产和实际应用。与它工业用酶相比，国内外对提高低温淀粉酶稳定性的研究相对较少。因此，本研究将来源于假交替单胞菌（Alteromonashaloplanktis）的低温淀粉酶AHA成功在大肠杆菌中进行了异源

3、表达并且利用两种理性设计策略提高了AHA的热稳定性。第一个策略是利用PoPMusic在线软件对低温淀粉酶AHA进行理性设计。通过去除基因中的保守位点和活性中心周围5埃以内的氨基酸，最终选择了8个对蛋白质去折叠自由能影响显著的突变体，经过初步的酶活力筛选和Tm值测定，最后得到2个热稳定性提高的突变体：N124P和A413G。这2个突变体的最适反应温度和pH与野生型相比均没有发生变化（最适温度30℃，最适pH7.0），然而单点突变体N124P和A413G的Tm值与野生型相比分别提升了1.02和1.85°C。此外，N124P

4、和A413G在40℃下保温80分钟后的残余酶活与野生型的残余酶活相比分别提升了28%和113%左右。第二个策略是利用分子动力学模拟和FoldX能量计算的理性设计方法。通过对蛋白质进行分子模拟和虚拟筛选，预测出10个热稳定性可能会有所改善的突变体。经过初步的酶活筛选和Tm值测定，最终得到了2个热稳定性显著提高的正突变体：S255K和S340P。这2个突变体的最适反应温度和pH与野生型相同。然而它们的Tm值分别比野生型提高了1.52和3.38°C。此外，S255K和S340P在40℃下保温80分钟后的残余酶活与野生型相比分

5、别提高了60%和140%。最后，我们把通过上述两种策略得到的4个单点突变体进行组合突变，得到了4个组合突变体S255K/S340P，S340P/A413G，S255K/S340P/A413G和N124P/S255K/S340P/A413G，其中热稳定性最好的是3点组合突变体：S255K/S340P/A413G。它的Tm值较野生型提升了6.38℃，同时在40℃下保温80分钟后的残余酶活与野生型的残余酶活相比提高了184%，并且它的最适反应温度和最适反应pH也没有发生任何变化。本研究利用两种分子改良的方法对低温α-淀粉酶A

6、HA进行理性设计，最终得到了4个热稳定性提高的单点突变体和4个热稳定性提高的多点突变体。然而这8个热稳定性提高突变体的最适反应条件与野生型相同。这些研究结果表明通过对蛋白质进行理性设计可以在不影响其最适反应条件的基础上改善其稳定性，为蛋白质的理性设计的发展提供借鉴，同时也为低温淀粉酶的工业化应用奠定了基础。关键词：低温α-淀粉酶AHA；热稳定性；定点突变；理性设计Improvementofthestabilityofcold-adaptionα-amylasethroughrationaldesignAuthor:Ya

7、n,YaruMajor:FoodEngineeringAdviser:Tian,JianAbstractComparedwithmesophilicamylasesandthermostableamylases,cold-adaptedamylaseshavehighactivityatlowtemperature.Thispropertycanbeextremelyuseful,asitcouldavoidspoilageandremainthenutritionalvalueandflavouroftheorigi

8、nalheat-sensitivesubstratesandproducts.Inaddition,thecatalyzedreactioninthelowtemperatureimpliesenergyconservationandenvironmentalprotection.However,thecold-adaptedam