牛口蹄疫鉴别抗体胶体金免疫层析方法的建立

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1、全日制硕士专业学位（毕业）论文牛口蹄疫鉴别抗体胶体金免疫层析方法的建立学位申请人：唐欣浩指导教师：赵月兰教授学位名称：兽医硕士学科领域：不区分研究领域授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月三日分类号：S855.3学校代码：10086密级：公开学号：20169200801牛口蹄疫鉴别抗体胶体金免疫层析方法的建立EstablishmentofColloidalGoldImmunochromatographicAssayforIdentifyingAntibodiestoFoot-and-MouthDiseaseinCattle学位申请人：唐欣浩指导教师：赵月兰教授学位名称：兽医硕士学

2、科领域：不区分研究领域授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月三日摘要口蹄疫（Foot-and-mouthdisease，FMD）是一种具有高度传染性的疾病，它发病急，传播快，易感动物种类多，主要侵害猪、牛、羊等经济价值大的牲畜和野生偶蹄兽，该病在世界流行广泛，造成的影响也极为严重。口蹄疫以疫苗免疫防控为主，但临床存在的自然感染和疫苗免疫现象，对该病的诊断带来了极大的困难。世界动物卫生组织（OIE）和世界口蹄疫参考实验室推荐使用的诊断方法在临床中条件受限，不易操作，而胶体金免疫层析技术日益发展成熟，在兽医临床检测应用广泛，它具有操作简便、用时短、结果直观可靠、较高的灵敏性和特异性等

3、优点，更适用于口蹄疫的临床检测。本试验利用DNAstar基因分析软件分析、筛选、预测出口蹄疫病毒的非结构蛋白3ABC中抗原性强，疏水性好、表面可及性优良、柔韧性强的2段氨基酸，将其对应的基因序列片段3ABCa和3ABCb，这2段基因之间用GSLinker序列连接，参考克隆载体的酶切位点并选定EcoRI和XhoI为酶切位点，将融合好的基因序列送与合成得到重组克隆载体pET28a-3ABCab。重组克隆载体存在于大肠杆菌DH-5α中，通过恒温振荡培养的方式对目的基因进行扩增，通过质粒提取、双酶切以及胶回收得到带有粘性末端的目的基因3ABCab，将其与线性化表达载体pET-28a(+)进行连接

4、得到重组原核表达载体pET28a-3ABCab，并将其转化入表达菌BL21(DE3)pLysS中。表达宿主菌经IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE电泳鉴定方法摸索最适的诱导表达时间、鉴别是可溶性表达还是包涵体表达以及确定表达蛋白带的大小为37.0kDa（含3.5kDa的pET-28a(+)肽段），与理论计算的目的蛋白大小一致。将鉴定正确的目的蛋白大量诱导表达，并分离纯化，透析复性，通过Weaternblot对纯化蛋白的免疫学活性进行鉴定，结果表明目的蛋白具有很好的免疫学活性，且融合基因能够在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中获得高效的重组表达。将获得的重组表达蛋白3ABCab提纯、

5、复性、浓缩后作为牛口蹄疫胶体金试纸条的检测线的包被抗原划线于NC膜上，葡萄球菌A蛋白(SPA)作为质控线的包被抗体划线于NC膜上，胶体金-SPA复合物喷涂到玻璃纤维素膜上制成金标垫，将已处理好的试纸条各部分组装制成牛口蹄疫抗体的胶体金免疫层析试纸条；用已制得试纸条检测牛口蹄疫标准阳性血清，10-15min内检测线处出现红色反应条带，质控线也出现红色反应条带，检测阴性血清时试纸条检测线未出现红色反应线，质控线出现红色反应线，表明试纸条在检测阳性血清时呈阳性反应，检测阴性血清时呈阴性反应，并且结果有效；试纸条检测线包被的抗原浓度为0.8mg/mL；试纸条检测口蹄疫阴性血清，牛口蹄疫疫苗免疫阳

6、性血清、牛副结核病、牛病毒性腹泻、牛布鲁菌病、牛传染性鼻气管炎阳性血清，结果都为阴性；用保存室温6个月的试纸条与保存46℃个月的试纸条分别检测牛口蹄疫阳性和阴性血清、疫苗免疫阳性血清，结果分别呈现阳性和阴性、阴性。所制备的试纸条具有灵敏，特异可区分自然感染和免疫动物的优点，稳定性好，15min内出结果，操作简便，可用于临床诊断。关键词：牛口蹄疫；胶体金；鉴别；免疫层析EstablishmentofColloidalGoldImmunochromatographicAssayforIdentifyingAntibodiestoFoot-and-mouthDiseaseinCattleAut

7、hor:TangXinhaoProfessor:ProfessorZhaoYuelanMaior:VeterinaryMedicineAbstractFoot-and-mouthdisease(FMD)isahighlycontagiousdisease.Ithasanacuteonset,rapidspread,andawiderangeofsusceptibleanimals.Itmainlyaffectspigs,cattle