SNT2058-2008进出口蜂王浆中氯霉素残留量测定方法酶联免疫法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０５８—２００８进出口蜂王浆中氯霉素残留量测定方法酶联免疫法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犮犺犾狅狉犪犿狆犺犲狀犻犮狅犾狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犈狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狅狉犫犲狀狋犪狊狊犪狔２００８０４２９发布２００８１１０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２０５８—２００８前言本标准的附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本

2、标准主要起草人：张晓峰、施伟良、朱振江、方莹、董强。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２０５８—２００８进出口蜂王浆中氯霉素残留量测定方法酶联免疫法１范围本标准规定了蜂王浆及冻干粉中氯霉素残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于蜂王浆及冻干粉中氯霉素残留量的测定。２规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ

3、／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法（ＧＢ／Ｔ６６８２—１９９２，ｎｅｑＩＳＯ３６９６：１９８７）３方法提要本标准以三氯乙酸来沉淀蜂王浆中的蛋白质和提取残留的氯霉素，然后以ＨＬＢ净化。微孔板中包被有绵羊抗兔ＩｇＧ抗体，加入特异性抗体（兔抗氯霉素抗体）、酶标记氯霉素、氯霉素标准品或样品提取液后，特异性抗体与包被的绵羊抗兔ＩｇＧ抗体结合，同时游离氯霉素和酶标记氯霉素竞争性的与特异性抗体结合。通过洗涤除去未结合的氯霉素和酶标记氯霉素，然后加入底物显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中氯霉素的含量。４试剂和材料除注明外，所有试剂均为分析纯，水

4、为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。４．１氯霉素检测试剂盒（参见附录Ａ）。４．２甲醇。４．３５％三氯乙酸：５．０ｇ三氯乙酸以水溶解并定容至１００ｍＬ。４．４３０％甲醇：３０．０ｍＬ甲醇（４．２）以水定容至１００ｍＬ。４．５异辛烷三氯甲烷混合液：异辛烷、三氯甲烷以２∶３（体积比）的比例混合。４．６ＨＬＢ小柱：Ｏａｓｉｓ（或相当产品），３ｍＬ（６０ｍｇ）。４．７氯霉素标准品：纯度≥９８％。４．８氯霉素标准品溶液的配制：称取０．０１ｇ氯霉素标准品，以甲醇定容至１００ｍＬ，配制１００μｇ／ｍＬ的工作液，于４℃～８℃条件下保存。４．９空白样品：选用已确切知道不

5、含有氯霉素的蜂王浆样品，作为空白样品。用于随样测试的加标监控实验。５仪器５．１酶标仪。５．２８道移液器：１０μＬ～１００μＬ。５．３单道移液器：１０μＬ～１００μＬ，２０μＬ～２００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ和２ｍＬ～１０ｍＬ。５．４混合振荡器。１犛犖／犜２０５５．５高速低温离心机：６０００ｒ／ｍｉｎ。５．６固相萃取装置。５．７氮吹仪。５．８具塞试管：５０ｍＬ。５．９电子天平：０．０１ｇ～１００ｇ。６试样的制备和保存６．１试样的制备原始样品总量不得少于２００ｇ，蜂王浆充分搅拌均匀后，将样品分成两等份；冻干粉采用四分法，将样品分成两等份。分好的样

6、品装入洁净容器，加封并做标识。６．２试样的保存试样放置－２０℃～－１８℃条件下保存。１）７分析步骤７．１提取称取２．０ｇ王浆样品，置于５０ｍＬ具塞试管中，加入８ｍＬ５％三氯乙酸（４．３），充分混匀，６０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上层液备用。ＨＬＢ小柱（４．６）依次用１ｍＬ甲醇（４．２）和１ｍＬ水活化，取２．５ｍＬ上层液上柱，依次以３ｍＬ水，１ｍＬ３０％甲醇（４．４）洗柱，去除残留的液体，再用２ｍＬ甲醇（４．２）洗脱，将洗脱液收集于一干净试管，氮气吹干，以０．５ｍＬ样品稀释缓冲液（试剂盒提供）溶解残留物，最后加入０．５ｍＬ异辛烷三氯甲烷混合液

7、（４．５）萃取，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上层水相进行分析供ＥＬＩＳＡ检测用，最后稀释倍数为１。王浆冻干粉则用水以１∶２比例稀释，充分浸泡（２ｈ以上）后，称取２．０ｇ按照上述王浆前处理方法进行提取，最后稀释倍数为３。７．２测定条件７．２．１酶标仪测定条件酶标仪测定波长为４５０ｎｍ。７．２．２洗板条件人工洗涤次数５次以上，每次加入洗涤液量为２５０。自动洗板可以预定５次周期。μＬ７．２．３操作条件所有操作应在室温下（２０℃～２４℃）进行，氯霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温（２０℃～２４℃）后方可使用。７．３测定步骤７．３．１将测定需用

8、的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准品及样品等在微孔架上的位置。７．３．２吸取１００μＬ零标准缓冲液于孔Ａ１、Ａ２；并吸取