大鼠终板软骨细胞向髓核迁移的规律及其机制的实验研究

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1、第一军医大学博士学位论文大鼠终板软骨细胞向髓核迁移的规律及其机制的实验研究姓名：王卫明申请学位级别：博士专业：外科学（骨科）指导教师：金大地20050511博士学位论文大鼠终板软骨细胞向髓核迁移的规律及其机制的实验研究博士研究生：王卫明指导教师：金大地摘要1研究目的：人体的椎间盘是肌肉骨骼系统中最易随年龄而发生退化的组织器官，椎间盘退变是引发下腰痛及颈椎病的常见原因，与其有关的生物力学和生物学变化在许多脊柱疾病中有病因学意义，因此，椎间盘退变成为I临床治疗和研究探索的焦点。虽然椎问盘退变的病因及病理变化还有许多未明了之处，有证据表明间盘退变可能起源于细胞的功能失调。髓核中的细胞生成了蛋白多糖、

2、II型胶原等细胞外基质成分，细胞外基质又决定了椎间盘的生理和生物力学功能，因此明确髓核中的细胞在自然增龄及退变过程中的变化规律及可能机制对深入研究椎间盘退变的发生机理和制定防治椎间盘退变性疾病的策略至关重要。既往的研究表明，出生后人类椎间盘的髓核组织经历了一种随时间而发生的慢性转化，新生儿期的髓核是由一种富含空泡的柔软凝胶状基质包绕多核索状物和脊索细胞簇而成。随着年龄的增长在脊索细胞数量逐渐减少的同时，髓核中出现软骨样细胞，并出现越来越多的胶原纤维，脊索性髓核逐渐被包含软骨样细胞的纤维软骨性髓核所取代。在这种髓核形态的转化过程中，软骨样细胞发挥了核心性的作用并最终成为成熟或成年髓核的主要细胞类

3、型。髓核中软骨样细胞的来源既有由脊索细胞转化而来的内源性学说，也有来自髓核以外组织的外源性学说，然而对成年髓核中软骨样细胞的起源仍存在争议。本研究制备符合人类疾病状态的双后肢大鼠增龄颈椎问盘退变模型，并设中文摘要正常对照组，研究髓核形态转化过程中软骨样细胞的来源，并通过测量透明质酸含量及三种生物大分子(CD44、ADAMl0、AD／kMl7)表达的变化规律，探讨终板软骨细胞向髓核迁移的可能机制。2材料与方法健康四周龄SD雄性大鼠76只，体重80～1009，随机分为两组，实验组40只，对照组36只。实验组按术后3、6、9、12个月四个时间段分组(E3、E6、E9、E12)，每组10只；对照组按实

4、验开始后4、8、12、16个月四个时间段分组(C4、C8、C12、C16)，每组9只。实验组大鼠以氯胺酮腹腔内麻醉，剂量O．19／kg，无菌条件下行腋部环形切口，于肱骨中上1／3离断，将上肢肌肉环形结扎于肢体残端以止血，术后动物于笼中自由活动。对照组大鼠未予任何处置，两组动物均以市售鼠料喂养。2．1建立双后足大鼠颈椎间盘退变动物模型的研究两组大鼠分别于术后相应时间段以过量乙醚麻醉处死，行颈椎正侧位X线摄片后，剔除周围肌肉，切取颅底到上胸段完整椎体标本，4％多聚甲醛(pH7．4)4。C固定20小时，20％EDTA脱钙，中矢状面连续切片，层厚4ttm，分别行H．E．、番红。染色，制备C2～C3到T

5、2一T3椎间盘单位组织学切片。根据x线摄片是否出现①椎体排列紊乱；②椎间隙变窄：⑧相邻椎体骨赘形成观察颈椎退变情况。组织学切片观察椎间盘形态学变化规律，并分别对软骨终板、纤维环及髓核的退变表现进行半定量分级。2．2颈椎间盘老化及退变过程中髓核形念转化及终板软骨细胞向髓核迁移规律的研究在不同时间段于下颈椎(c。、C。。C。)中矢状平面连续切片取材进行HE、番红0染色，在普通光学显微镜下观察终板软骨细胞向髓核迁移及脊索性髓核被软骨性髓核替代的变化规律。2．3终板软骨细胞向髓核迁移机制的研究II博士学位论文同动物模型研究另设实验组及对照组，每阶段各8只大鼠，测量C5—6椎间盘透明质酸(HA)含量的变

6、化；利用细胞迁移形态学观察的组织切片进行免疫组化染色，检；测CD44、ADAMl0及ADAMl7在自然增龄及颈椎问盘退变过程的表达特点及分布规律。3结果3．1制备双后足大鼠颈椎间盘退变动物模型的实验研究对照组16个月仅部分大鼠出现轻度颈椎间盘退变的影像学表现，而实验组9个月即全部出现不同程度的退变征象，以E12组大鼠及c扣5、C5如C6．7椎f刚隙表现明显。C4、C8、C12组大鼠大多数椎间盘组织学表现正常。C16、E3及E6组大部分椎间盘的脊索性髓核皱缩，髓核组织中大多数为软骨样细胞，脊索细胞数量较少且大部分出现变性，软骨终板变薄、前部纤维环层状结构消失，个别椎间隙可见脊索性髓核消失及纤维环

7、的裂隙。E9组椎间盘退变加剧，表现为脊索性髓核完全被纤维软骨样组织替代、纤维环出现裂缝、软骨终板变薄并出现缺损。个别间隙可见椎间盘突出及相邻椎体的骨赘形成。E12组的椎间盘退变最严重，表现为软骨终板消失、椎间盘突出及相邻椎体前缘骨赘形成。各组动物纤维环、髓核及软骨终板退变的半定量分级表明，实验组颈椎问盘退变较『F常对照组发生的更早且更严重。3．2颈椎间盘老化及退变过程中髓核形态转化及终板软骨细胞向