tgfβ1转染大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验的研究

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1、·英文缩略语·6中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：堕里圭日期：揶矿．今．码中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的

2、规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：1}锣谬予!么眵’卿r．岁．9-5·中文论著摘要·TGF．p1转染大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究实验目的探讨大鼠脂肪干细胞(Ad

3、iposederivedstemcells，ADSCs)的分离、培养、扩增及表型鉴定方法。研究应用TGF．Dl基因转染大鼠ADSCs，诱导其向软骨细胞分化，比较目的基因的分泌情况及向软骨细胞分化效果，为软骨组织工程学种子细胞提供新方法。实验方法先行质粒pcDNA3．1(+)一TGF一11扩增、提取和酶切鉴定。取大鼠大网膜及肾周脂肪囊等处脂肪组织，眼科剪剪碎，加入3倍体积0．1％的I型胶原酶，酶消化法及密度梯度离心法相结合，分离、纯化SD大鼠ADSCs，倒置显微镜观察培养各代ADSCs的形态。取第3代脂肪干细胞，免疫荧光法检测其

4、表面抗原CD29、CD44、CDl06、CD34表达。将TGF．p1基因转染ADSCs，按转染情况分为4组：未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染TGF．p1组(C组)、转染TGF．pl组(D组)。对转染后细胞进行筛选，MTT法测定筛选后细胞的增殖活性，RT．PCR检测TGF—p1、SOX9、Aggrecan年ICollagenII(Coil—II)mRNA表达，Westernblot检测TGF．B1、Coil．II蛋白表达。实验结果1、TGF．11质粒鉴定测序结果与GenBank基因序列相符。2、原代培养的脂肪干细胞l

5、dl[1可在培养皿内见细胞贴壁，贴壁细胞呈类圆形；2d后长梭形细胞逐渐增多；4．5d后细胞呈典型团簇状生长，形成集落；约7d左右细胞融合超过90％时；3代后细胞形态比较均一，呈大长梭形。3、大鼠ADSCs的鉴定免疫荧光法检测ADSCsCD44、CD29呈阳性反应，CDl06、CD34呈阴性反应。4、MTT法检测转染基因对ADSCs增殖活性的影响C、D组的吸光度值明显高于A、B组，与A、B组之间的差异具有显著性(P<0．01)，而C组和D组、A组和B组之间差异无统计学意义(P>0．05)。5、RT—PCR检测TGF一131、SO

6、X9、Aggrecan、Coil—IImRNA表达mRNA显示C、D组TGF—B1、SOX9、Coil-II、和Aggrecan的mRNA表达增强。除TGF-131在A、B组表达外(A、B组比较P>0．05)，余下各检测指标在未转染组和转染转空载体组均未见表达。6、Westernblot检濒JJTGF．131、Coil．II蛋白表达C、D组的TGF．131、Coll．II的蛋白表达高于A、B组，差异具有显著性(P<0．01)，A、B组间的差异无统计学意义(P>O．05)。结论大鼠ADSCs经分离，纯化，扩增，生物学性状稳定。A

7、DSCs能稳定地表达CD29、CD44，CDl06、CD34表达阴性，证明其为干细胞来源。转染TGF．131后ADSCs细胞的增殖能力增强。稳定转染TGF．p1后的ADSCs能够持续表达和分泌TGF．131基因和蛋白。转染TGF．131基因后的ADSCs成功表达软骨细胞的特异性基质，具有了软骨细胞的生化特征。采用脂质体作为载体，安全、无毒副作用，经基因修饰过的ADSCs携带了诱导其向软骨细胞分化，促进基质分泌的细胞因子的基因，因此，经TGF．p1基因修饰的ADSCs可以作为软骨组织工程的种子细胞来源。关键词脂肪干细胞；基因转染

8、：转化生长因子131；分化；大鼠2·英文论著摘要·AnExperimentalStudyonDifferentiationintoChondrocytesofRat’sADSCsTransfectedbyTGF—p1GeneObjectiveToinvestigatethei