云芝菌丝体多糖的分离纯化研究

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1、天活产物研究与开发2003Vo1.15Na.lNATf琅ALPRQDUCrPF4;ZPARCiANDDEVELOP[ENC云芝菌丝体分离纯化研究余晓斌铃尤蓉(江南大学生物工程学院下AM物技术教育部重点实验室江苏无锡214036摘要利用热水抽提从云芝菌丝体中提取胞内多糖，初步纯化后，用DEAE-SephamseC1,6B进行分离，从中分离出两个带电荷多糖组分即CvP-I和CvP-II，对这两个组分分别用SepharoseCI-6B凝胶柱层析进行纯度鉴定，均出现单一峰，然后用紫外扫描发现这两个组分均出现蛋白多糖的特征吸收，从而可以判断这两个组分是蛋白结合多糖。关键词云芝;

2、蛋白多糖云芝多糖是从云芝中提出的多糖，也可以从人1.2.2多糖定贡浏定:硫酸一苯酚法闹工培养的菌丝体中提取，是一种新型的抗肿瘤免疫1.2.3蛋白质去除:Sevag试剂与多糖水溶液混调节剂[l1。从菌丝体中提取的胞内多糖是含蛋白合，直至中间层不形成白色沉淀为止川质的糖肤，主要成分以件(1,4),件(1,3)或件(1,4),1.2.4样品脱色:往多糖水溶液中在声8下滴加终(1,6)为主链，上有昆(1,3)或件(1,6)结合的分20%的氏q[81枝，多糖含量30-60%，蛋白质含量10-30%，单糖1.2.5益析去除盐及小分子:样品溶液装人透析组成主要是葡萄糖，其次为甘露糖

3、，少量的半乳糖、袋，扎紧袋口，悬浮于纯净水中，每8个小时换水一木糖和岩藻糖。云芝糖肤能抑制人肺癌、胃癌、白血次，透析3天。病、淋巴癌细胞及腹水癌等多种癌细胞的增生z一习。1.2.6X子交换色谙法一DEAFSepharoseCL6B因此，对于云芝多糖的分离纯化和结构研究具离子交换柱层析有重要意义。柱规格:2.6x50cm;Vt=240ml;流速:1.67ml/min;上柱体积:12ml;每管收集5ml1方法与材料洗脱方法:首先用500rnl水洗脱，然后用NaCl1.1试荆与材料溶液进行梯度洗脱。DEAI

4、.2.7凝胶过滤色语-SepharoseCL6B凝胶柱层CL6B:Sigma公司透析袋:Sigma公司;均质机;析I91SBS100数控计滴自动部份收集器:上海沪西仪器1.2.8紫外扫描:对样品水溶液在190--360run厂;100型崛动泵:上海青浦沪西仪器厂;721分光光区间进行扫描。度计:上海第三分析仪器厂;梯度混合器:上海沪西2实验结果与讨论仪器厂;旋转蒸发器:上海医疗器械厂;紫外扫描仪HITACHI旧本。在整个分离纯化的过程中，总共包括以下几个1.2实验方法步骤:1.2.1菌丝体胞内多糖的提取，采用热水抽提，具(1)初步纯化:酒精沉淀粗多糖~粗多糖重新溶体流

5、程如下:于水，收集滤液~浓缩一多糖水溶液”脱蛋白‘脱发酵液斗离心一菌体~洗涤‘调配~破碎‘热色~脱盐。水~抽提冲离心一收集滤液‘浓缩~酒精沉淀”胞(2)精制分离:利用DEAE-SepharoseCL-6B离内粗多糖子交换色谱，对中性多搪和离子多糖进行分离。2.1DEAE-SepharoseCLBB离子交换色谱分离纯化云芝多糖收稿日期2002-01-04修回日期:2002-07-09辱江苏省应用基础项目200026DEAE-SepharoseCL-6B是载体基质Sepharose通讯联系人(Correspondingwthor)CL-6B与带电荷基团结合成离子交换剂，可

6、以根据&tnail:汕yu@msil.sytn.edn.m物质的带电性、极性和分子大小差异而予以分离。万方数据天然产物研究与开发2003Vo1.15No.1因此利用DEAE-SepharoseCL-6B来对云芝多糖进脱部分占75.84%的比例，可以初步估计，云芝胞内行分离。在实验过程中，水洗后，用两种离子梯度洗多糖大部分是极性或是带电荷多糖，其中极性或是脱，实验结果如图:带电荷多糖又由两个组分组成即CVP-I和CVP-(1)用0-1mol的NaCl洗脱II。︵1002.2为进一步鉴定这两个组分是否单一，在毛/纷soSepharoseCL-6B凝胶柱上进行了纯度鉴定。其

7、结).P石0果见图3,4:石占20吕40︵邑准18硬20、16罗资︶召140姚巨12-20吃10。落5卜图1用0-1rro】的NaCl洗脱曲线图弓6﹄包4Fig.IChnanamgap卜of浏ysacchridefromCoridus姚2cesimforonDEAESephamseCL6Bwith0一10510molNaCA管号Tubemmhw从图1中可以看出，从0号管到45号用水洗图3CVP-工的凝胶柱层析图脱，并用完洗脱水(多次试验，经检测没有多糖，不收Fig.3GelchrcxnatogaaphyofCVP-IonSePhameeCL集洗脱液)