乙酰肝素酶促进肿瘤转移分子机制的最新研究进展

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·102·安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2008Feb;12(2)乙酸肝素酶促进肿瘤转移分子机制的最新研究进展徐波，陆茵(南京中医药大学中医药研究院，江苏南京210029)摘要:乙酞肝素酶是目前发现的哺乳动物细胞中唯一能切割细胞外基质中硫酸肝素蛋白多糖侧链的内源性糖昔酶，参与许多病理及生理的过程。本文对乙酞肝素酶与肿瘤转移的高度相关性以及该酶参与肿瘤转移的分子机制等方面进行了综述，乙酞肝素酶会通过促进肿瘤血管生成、影响细胞分化以及促进肿瘤细胞钻附作用和侵袭能力等途径促进肿瘤的播散，因此可以将乙酞肝素酶作为抗肿瘤药物的靶点。本文对用筛选乙酞肝素酶抑制剂的方法、寻找抗肿瘤新药的最新进展做了概述，旨在为肿瘤转移机制研究，寻找治疗方法提供一些线索。关键词:乙酞肝素酶;乙酞硫酸肝素盐;血管生成;肿瘤转移ResearchprogressinheparanasepromotingtumormetastasisXUBo,LUYin(InstitutionofTraditionalChineseMedicine,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing,Jiangsu210029)Abstract;Heparanaseistheonlymammalianheparansulfate-degradingenzymes;itcouldcleaveheparansulfate(HS)whichlinkstoheparansulfateProteoglycans(HSPGs).Inthisreview,theheparanase'seffectsontumorangiogenesis,itsexpressioninnormaltissue,tumortissueandmetastatictissue,anditscorrelationtotumormetastasisweredescribed;recentprogressinsearchingfornovelantitumordrugsthroughscreeningforinhibitorofheparanasewassummarized.Keywords:heparanase;heparansulfate;angiogenesis;tumormetastasis硫酸乙酸肝素蛋白多糖(heparansulfateproteoglycans存在的FGF不能自由扩散，难以接近靶细胞，HSPGs相当于HSPGs)是细胞外基质和基底膜中重要的组成部分，在生理情bFGF在ECM的储存池。HS使FGF。处于失活状态，但可作况下硫酸乙酞肝素(heparansulfate,HS)侧链与不同的蛋白相为低亲和力的辅助受体促进HS-FGF-FGF受体复合物的形连，它的降解可能参与妊娠、形态发生、炎症的发展、血管生成成，这种复合物比单纯的FGF更容易在ECM或基底膜中扩和肿瘤转移等一些基本生物过程，因此HSPGs的降解将改变散，并易接近靶细胞发挥其生物学效应，有利于促进FGF受组织的完整性和功能状态。1975年，Hook等m报道在大鼠体的二聚体形成和信号的转导。肝素酶裂解HS释放出的的肝组织中发现降解HS的内切糖昔酶的活性，这是对于肝HS片段和促进FGF与受体结合及形成二聚体所需的HS长素酶活性的首次报道。作为恶性肿瘤重要功能酶的肝素酶，度恰好相似，HS片断还可以促进具有促有丝分裂活性bFGF它是体内唯一能够将降解HS的葡糖醛酸，并在特定部位裂的生成[3J。解HSPGs从而促进肿瘤的转移和浸润，可以作为早期肿瘤诊1.1.3与血管内皮生长因子(VascularEndothelialGrowthFac-断及其预后推测的特征性指标。肝素酶常在高侵袭细胞中表tor,VEGF)的关系VEGF表达的高低对肿瘤发生发展以及血达，尤其是转移的肿瘤细胞，因此可以作为抗血管生成、抗转管生成起着很重要的作用[’]，肝素酶降解HS后，释放出与HS移、抗炎的良好的分子靶点。稳定结合的VEGF，作为血管生成因子，招揽内皮细胞，促进血1肝素酶促进肿瘤转移的机制管新生。ZetserA等[s1研究发现在肝素酶高表达的MDA-MB-1.1促进血管生成435人类乳腺癌细胞和大鼠C6神经胶质瘤细胞中VEGF的蛋1.1.1与内皮细胞(EndothelialCell,EC)的关系肝素酶溶白及mRNA的表达均有3一5倍的增高而且伴有p38磷酸化程解内皮下血管基底膜(Basicmembrane,BM)有利于ECs的侵度的升高，户8抑制剂不能降低由肝素酶引起的VEGF的增高，袭、迁移、增殖，为内皮细胞向血管生成因子的趋化扫除障碍，但是Src的抑制剂却能够完全消除这种作用，说明肝素酶可能以芽生的方式直接促进血管生成。肝素酶的mRNA在处于是通过SO家族成员的活化来调节VEGF基因表达。增殖状态的ECs中有高表达，而在成熟的静态血管ECs却没1.1.4与尿激酶型纤溶酶原激活物(UrokinasePlasminogen有表达。肝素酶还能加强蛋白激酶B/Akt信号转导途径，激Activator,uPA)关系肝素酶可释放结合在HS上的尿激酶型活邻近的内皮细胞，刺激磷脂酞肌醇(一)激酶依赖的内皮细纤溶酶原激活物(uPA)溶解基质网状结构，uPA还可通过活化胞的侵袭和转移，为血管生成创造条件[’]。表皮生长因子(EpidermalGrowthFactor,EGF)激活细胞外基质1.1.2与碱性成纤维细胞生长因子(BasicFibroblastGrowth中的蛋白质酶联反应，使膜的功能降低，屏障功能减退。Factor,bFGF)的关系肝素酶降解HS侧链，将具有高度活性1.1.5与环氧化酶一(Cyclo-oxygenase-2,COX-2)的关系的HS-bFGF复合物从ECM和肿瘤微环境中释放出来促进肿COX-2会诱导促进VEGF和bFGF生成从而促进新生血管的瘤细胞、成纤维细胞、内皮细胞增生迁移。在体内，bFGF可与形成。ImadaT等[[b]通过对59名侵袭性乳腺癌患者和85名血管内皮下的ECM及基底膜中的HSPG结合，这种结合方式原位管乳腺癌患者组织标本表明，肿瘤组织肝素酶的分布与COX一分布相同且两者表达正相关，说明肝素酶可能是通过基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30371727)Cox一途径来促进血管生成。NaomotoY等【’{研究发现在肝万方数据 安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2008Feb;12(2)·103·素酶诱导COX一上调的过程中，三种主要的转录因子结合位B16BL6鼠的黑色素瘤细胞及13762MAT鼠乳腺腺癌细胞共点一NF-kappaB,NF-IL-6,CRE位点发挥了相互协作和相互补同作用后发现肝素酶活性受到抑制。ZhangZH等〔161利用小充的作用。OkawaT等[181对77个原发食管癌肿瘤组织进行分子，发现在体外被转染的细胞株肝素酶表达水平下降，侵袭分析，发现在食管癌组织中肝素酶蛋白表达与COX一正相力和勃附力显著降低，体内表现为血管分布减少，转移能力的关，转染肝素酶的食管癌细胞COX-2的mRNA及蛋白均上下降，进一步证明了肝素酶在肿瘤的发展中起着重要作用。调，COX一启动子被激活且其中能强烈抑制启动子活性的三在中医药研究方面，对于肝素酶抑制剂的研究也取得了长足个转录子(环磷腺昔反应元件、核因子一kappaB、核因子一白介的进展，LiuXY等[”〕研究发现苦参碱可以抑制恶性黑色素瘤素-6cyclicAMPresponseelement,nuclearfactor-kappaB,and细胞A375的mRNA表达来减低细胞的侵袭力，并且这种抑nuclearfactor-interleukin-6)结合位点发生缺失或突变。制作用呈剂量依赖。1.2猫附作用肝素酶的活性与其环境的pH值有关，它既3结语可以作为酶，也可以作为勃附分子，与局部pH值有关。在酸作为肿瘤细胞浸润、转移的关键酶，乙酸肝素酶已被越来·性条件下，肝素酶作为酶，降解HS;当pH高于7.0时，肝素酶越多的人所重视。随之而来的将是有效抗肿瘤药物的进一步作为勃附分子，结合HS，锚定人的T淋巴细胞，因此，局部组筛选，同时也能继续验证这一机制，为最终明确肿瘤发病原因织的状态决定其是作为酶还是作为钻附分子。无薪附力的鼠和机制提供可靠的理论基础。目前，仍存在不少问题函待解Eb淋巴瘤细胞转染肝素酶后表现出对ECM的强勃附力，而决，例如:肝素酶的三维结构尚不明确;高转移潜力的肿瘤中，细胞的勃附不受肝素酶抑制剂的影响，提示此功能不依赖于肝素酶基因如何得到高表达;肝素酶与其他的降解ECM的酶它的糖昔内切酶活性，肝素酶调节的这种早期的细胞勃附作之间有无联系等。此外，对肝素酶抑制剂的研究大部分还只用会导致整合素依赖细胞的扩散、桩蛋白的酪氨酸磷酸化、肌处于动物或体外实验阶段，距离临床应用还有很长的距离。动蛋白细胞骨架的重组。肝素酶的这种特性对于肿瘤细胞的对这些课题进行深人的研究，将丰富肿瘤学研究，并为临床肿勤附、迁移、侵袭起了重要的作用，并且协同其降解ECM的酶瘤治疗提供新的手段。活性促进肿瘤转移和血管新生[M。参考文献:1.3影响细胞分化编buhisaT等〔10]也发现具有酶活性的川H66kM,WastesonA,OldbergA.^heparansulfate-degradingen-肝素酶向核内转运会促进细胞的分化，将肝素酶转导人人类doglycosidasefromratlivertissue[J].BiochemBiophysResCom-乳腺上皮癌细胞内，肝素酶被转运至核内，发现核内肝素酶的mun,1975,67:1422一8.[2]SvetlanaGV,AnnaZ,MosheY.Flugelman,etal.Hepamnasein-表达会导致细胞分化，出现脂滴，证实了肝素酶在对上皮细胞ducesendothelialcellmigrationviaproteinkinaseB/Aktactivation的分化方面的作用。[J].TheJournalofBioiogicalChemistry,2004,279(22):23536-1.4其他肝素酶降解HS侧链，破坏血管基底膜和细胞外41基质中HSPGs，协同基质金属蛋白酶(MatrixMetalloprotein-[3]ReilandJ,KempfD,RoyM,etal.FGF2binding,signaling,andase,MMPs)破坏ECM和BM，使得ECM,BM稳定性下降，细angiogenesis，modulated坷heparanaseinmetastaticmelanoma胞间质屏障功能降低。肝素酶降解HSPG，所得的产物会抑cells[J].Neoplasia,2006,8(7);596一606.制活化的T淋巴细胞的生物活性，从而引起免疫抑制，使肿瘤[4〕张明林，许建明，梅俏，等.结肠癌中MMP一和MMP-9蛋白表达与微血管计数的关系〔J].安徽医药，2007,11(2):146一9.更易转移[，，〕。肝素酶可以诱导血管内皮细胞和肿瘤细胞组织因子[51ZetserA,BashenkoY,EdovitskyE,etal.Heparanaseinduces，(TissueFactor,TF)的表达。NadirY等[12]研究发现，转染肝cularendothelialgrowthfactorexpression:correlationwith户8素酶cDNA的肿瘤细胞中肝素酶过量表达，而体内体外实验phosphorylationlevelsandSrcactivation[J].CancerRes,2006,66(3):1455一63.发现组织因子的表达也随之增加，未激活的肝素酶也可诱导[6]ImadaT,MatsuokaJ,NobuhisaT,etal.COX-2induction勿hepara-组织因子的表达。在这一过程中，肝素酶对组织因子的调节naseintheprogressionofbreastcancer[J].IntJMolMed,2006,17作用是通过激活P38信号通路而实现的。(2):221一8.2肝素酶抑制剂[7]NaomotoY,GunduzM,TakaokaM,etal.Heparanasepromotesan-肝素酶作为一种肿瘤转移潜在根源被人们认识后，其抑giogenesisthroughCox-2andHIFI咖ha〔J].MedHypotheses,制剂的研究和筛选成为人们寻找肿瘤治疗新药物的方向。可2007,68(1):162一5.以溶解ECM中的多肤蛋白酶有许多种，而降解ECM中的HS[8]OkawaT,NaomotoY,NobuhisaT,etal.Heparanaseisinvolvedin只有一种肝素酶。肝素酶抑制剂的设计主要根据HS或其类angiogenesisinesophagealcancerthroughinductionofcyclooxygen-似物一肝素，化学修饰肝素或相关的硫酸多糖，它们的抗转移ase-2[J].ClinCancerRes,2005,11(22):7995一8005.[9]Goldshmidt0,ZchariaE,CohenM,etal.Heparanasemediatescell活性与抑制肝素酶活性是相关的。肝素能作为肝素酶的底adhesionindependentofitsenzymaticactivity[J].FASEBJ,2003，物，延缓肝素酶对HS的降解，肝素片段无论抗凝活性的高17(9):1015一25.低，表现出相似的抗肝素酶和抗转移活性〔‘，1。两种硫酸低聚[10]NobuhisaT,NaomotoY,OkawaT,etal.Translocationofheparanase糖〔磷酸甘露戊糖硫酸脂P188、六甲麦芽糖〕和海带多糖均具intonucleusresultsincelldifferentiation[J].CancerSci,2007,98有抑制肝素酶和抑制血管生成的重要特性〔14],P188从酵母菌(4):535一40.发酵而来，体外实验证明其具有很好的抑制血管生成和抑制[11]GohjiK,KatsuokaY,OkamotoM,etal.Humanheparanase:rolesin肝素酶活性的作用，已经进入II期临床试验，可用于治疗黑色invasionandmetastasisofcancer[J].HinyokikaKiyo,2000,46素瘤、肝癌、肺癌等肿瘤。Miao等〔15]用硫酸昆布多糖对(10):757一62.万方数据 ·1以·安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2008Feb;12(2)O药学研究O爽咽茶提取工艺研究吴新安(中国人民解放军第105医院制剂室，安徽合肥230031)摘要:目的建立爽咽茶处方制备的合理工艺。方法以总皂昔、总固体物为指标，采用正交试验法对提取工艺进行优选。结果最佳提取工艺为水煎煮法提取3次，每次加入12倍量水，煎煮1h。结论该制备工艺操作可行、质量可控。关键词:爽咽茶;正交试验法;提取工艺OptimizationofextrationprocessofshuangyanchaWUXin-an(The105HospitalofPLr1,Hefei,Anhui230031)Abstract:AimTooptimizetheextractionprocessofshuanyancha.MethodTheorthogonaldesignwasadoptedtooptimizetheextrac-tionprocess.Thetotalastecontentandthetotalsolidsubstancesweredeterminedtoevaluatetheeffectofextractionofdiffer-entprocesses.ResultsTheoptimumextractingprocesswere12timeswater,extractingfor1h,for3times.ConclusionTheoptimalextractionprocessissimpleandrepeatable.Itcanbeusedinindustrialproduction.Keywords:shuangyancha;orthogonaldesign;extractionprocess爽咽茶是纯中药制剂，是已故我国著名耳鼻喉科专家肖的清膏，采用一次醇沉法进行沉淀。试验以总皂昔得率作为轼之教授在清宫代茶饮秘方《银花代茶饮》和《玄参麦冬汤》指标，分别考察50%,60%,70%醇浓度沉淀效果，探索合适基础上组建的经验方[Usl，方中主要包括金银花、木蝴蝶、菊的醇沉浓度。花、玄参、麦冬、桔梗、蝉蜕、胖大海、甘草药材，临床长期用于1.3评价指标治疗急慢性咽炎，并取得了显著疗效。本资料报到其处方制1.3.1总皂替的定性和浏定精密吸取正交试验水提取浓备工艺筛选。缩液20ml，以水饱和正丁醇提取5次(20mlx5)，合并正丁，且材料与方法醇液，以正丁醇饱和的水100ml洗涤1次，弃去水洗液，正丁月.‘1且:材料试验所需的药材均购自毫州中药市场。醇液置水浴上蒸干，残渣加甲醇(20,10,5ml)分次溶解，滤月，1创方法过，滤液置水浴上浓缩至10一20ml，放冷，加乙醚50m1，振1.2.1水煎煮工艺研究选取总皂昔、总固体得率作为水煎摇，放置至澄明，弃去上清液，沉淀加甲醇(20,10,5ml)分次煮提取正交试验考察指标，用场(3a)正交方案，分别对煎煮溶解，放冷，滤过，合并甲醇液，置水浴上浓缩至10一20ml，放时间、煎煮次数、加水量3个因素，并结合生产实际，每因素选冷，加乙醚50ml，振摇，同上法处理，合并甲醇液，置水浴上浓取3个水平进行正交试验(表1)0缩至10ml作为样品溶液。取样品溶液30闪点于含有0.7%裹1水煎煮工艺考察因紊正交表梭甲基纤维素钠溶液作为粘合剂的硅胶G薄层板上，以展开水平煎煮时间A煎煮次数B加水量C剂正丁醇:乙酸乙酷:水(4:1*5)上层液为展开剂展开11em,，次0.5h110倍，次取出晾干，喷显色剂硫酸一甲醇(l:1),置105℃加热直至显黄‘1.0h12倍飞次色进行定性检测。同时样品溶液全部置于已恒重的蒸发皿1.5h曰巧倍中，于水浴上蒸发至干，在105℃干燥至恒重，计算，即得总皂昔量。1.2.2醉沉浓度考察水煎煮液经浓缩至一定的相对密度[121NadirY,BrennerB,ZetserA,etal.Heparanaseinducestissuefac-，andtumormetastasisbylaminarinsulfateandsynthetictorexpressioninvascularendothelialandcancercells[J〕.Jhioate[J].IntJCancer,1999,83(3):424一31.ThrombHaemost,2006,4(11):2443一51.[16]ZhangZH,ChenY,ZhaoHJ,etal.SilencingofheparanasebysiR-[13]HariG,NaiyaratanaC,DeborahA,etal.HeparinoligosaccharideNAinhibitstumormetastasisandangiogenesisofhumanbreastcanc-sequenceandsizeessentialforinhibitionofpulmonaryarterysmootherinvitroandinvivo[J].CancerBiolTher,2007,19,6(4).18.musclecellproliferation[J].CarbohydrateRes,2002,339(21-[17]IauXY,FangH,YangZG,etal.Inhibitionofinvasivenessand，23):2359一64.pressionofheparanase-mRNAinhumanmalignantmelanomacell[14]ElkinM,IlanN,Ishai一MichaeliR,etal.Heparanase.mediatoroflineA375bymatrine[J].ZhongYaoCai,2006,29(3):253一6.angiogenesis:modeofaction[J].FASEBJ,2001,15(9):1661一3.(收稿日期:2007-09-24)[15]MiaoHQ,ElkinM,AingornE,etal.Inhibitionofheparanaseactivity万方数据