一氧化氮在静水压下对人体腰椎间盘蛋白多糖合成的影响(1)

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1、一氧化氮在静水压下对人体腰椎间盘蛋白多糖合成的影响柳根哲1，徐林1，HirokazuIshihara2(1．北京中医药大学东直门医院骨科中心2．日本富山医科药科大学骨科)随着我国老龄化社会的到来，由椎间盘退变造成的颈、腰椎疾病日益构成对人民健康的威胁并严重影响患者的生活质量(QOL)o椎间盘退变不仅表现为一系列组织形态学上的变化，而且椎间盘退变的主要生物化学变化是蛋白多糖丢失，导致椎间盘功能丧失而引起下腰痛。椎间盘的长期健康状态取决于椎间盘细胞的活力，即保持基质蛋白多糖含量。目前尚无学者报告有关静水压对人体腰椎间盘一氧化氮产生的影响的

2、相关报导。此研究探讨一氧化氮对人体腰椎间盘组织蛋白多糖合成的影响及静水压对蛋白多糖合成调节过程中一氧化氮是否起到中间介质作用1材料和方法1．1材料从72例后方腰椎间盘摘除术的志愿患者中获取新鲜的72个椎间盘样品。其中男性4l例，女性3l例。年龄18—78岁，平均年龄45．9岁。取得样品的椎间隙，其中取自L2一，1例，取自b。45例，取自L4。，36例，取自L，～S，30例。试图确定取出的样品是髓核还是纤维环，但多数是无法分辨清楚。首先用生理盐水冲洗样品上的血液和组织液。为使个体偏差减到最小，在湿性环境下将样品精细地切成1．O一2．0l

3、ilm3大小的碎块。每个椎间盘样品，精细地切成约50mg(湿性质量)碎块后，其每个样品的浓度几乎相同o1．2方法1．2．1组织培养使用不含碳酸氢钠培养基DMEM，添加链霉素100mg／mL和青霉素100U／mL，用N一2一羟乙基哌嗪一N一2一乙磺酸和氢氧化钠调节pH值至7．4，经无菌过滤处理。为保持细胞外生理渗透压及代谢活性接近体内环境，将蔗糖100卜mol／L添加到培养基中。将如前所述获得的每l例样品随机分成对照组(0．1MPa)和实验压力组(O．3MPa，3MPa)o各组的每个样品均和lmLDMEM装入2．5IIll塑料注射器中，

4、并将空气排空。对照组塑料注射器在一个大气压下(O．1MPa)，37oC水槽中培养；压力组放入37℃充满蒸馏水的在各种各样的静水压环境下能够培养椎间盘组织的装置中(由日本富山高穗公司定做)，分别施加0．3MPa静水压(相当于仰卧位时腰椎间盘内静水压)，3MPa静水压(相当于向上抬重物时腰椎间盘内静水压)的条件下培养，探讨静水压对一氧化氮产生(18每个样品)和蛋白多糖合成率(18每个样品)的影响。另外添加一氧化氮合成酶的竞争性抑制剂NG—methyl—L—arginine(简称L—NMA，10一10001xm01)和一氧化氮的供体S—ni

5、troso—N—aeetylpenieilla—mine(简称SNAP，l一200txm01)条件下培养，探讨L—NMA(18每个样品)或SNAP(18每个样品)对蛋白多糖合成率和NO产生的影响；在静水压0．1MPa，及3、30MPa的条件下L—NMA对蛋白多糖合成率的影响。将L—NMA或SNAP分别添加在需要的部分培养基中。1．2．2蛋白多糖合成率的测定首先在4qC，含有”S一硫酸盐185kBq／mL的(日本生物化学用品公司)DMEM培养基中将获得的样品提前1h预先培养，以便使35S一硫酸盐均匀完全地扩散到椎间盘基质中。手术获得的每

6、一例样品分成对照组和实验压力组均在37℃培养2h，培养后立刻转移到一28。C冻结，终止蛋白多糖合成。进行测定时，解冻溶解，提取基质中的每个样品来测定其活性。将样品椎间盘组织和培养基装入纤维素透析分析袋(分子量12000—14000；日本大版和光纯药工业公司)密封。在4℃，3d在流水中透析到检测不到35S一硫酸盐为止。用放射率测定装置(日本东京Aloka公司，LSC903)测定其放射活性。蛋白多糖合成率用Bayliss方法计算单位干燥重量、单位时间的35S一硫酸盐结合率。静水压对蛋白多糖合成率的影响以压力组(O．3，3MPa)与对照组(

7、O．1MPa)结合35S一硫酸盐之比率表示o1．2．3培养上清液中的亚硝酸盐浓度测定外科手术获得的每一例样品分成对照组和实验压力组均在37℃培养24h，培养后立刻转移到一28℃冻结。测定时在室温下溶解，离心机调至10．000r／min、离心10min，将分离的椎间盘组织，真空干燥后称质量。使用测定亚硝酸盐／硝酸盐的Griess试剂(日本盐井化学药品公司)，用分光光度法测定培养上清液中一氧化氮稳定的最终产物亚硝酸盐浓度来做为一氧化氮的产生量。简单地说，100I山mol培养上清液-9100斗molGriess试剂混合，在37℃培养10mi

8、n，用微量光度仪(日本大阪Bio—Rad公司)，以540nm测定最理想的浓度。静水压对一氧化氮产生的影响以压力组(O．3，3MPa)与对照组(O．1MPa)之比率表示o1．2．4统计学分析实验数据采用x±S表示。由作者用