SNT1586.2-2008菜豆晕疫病菌检疫鉴定方法.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１５８６．２—２００８菜豆晕疫病菌检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊狊犪狏犪狊狋犪狀狅犻狆狏．狆犺犪狊犲狅犾犻犮狅犾犪（犅狌狉犽犺狅犾犱犲狉）犌犪狉犱犪狀犲狋犪犾．２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜１５８６．２—２００８前言本部分的附录Ｂ和附录Ｃ为规范性附录，附录Ａ为资料性附录。本部分由国家认证认可监督

2、管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本部分主要起草人：刘鹏、崔铁军、廖芳、刘跃庭、冯洁、王金成。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜１５８６．２—２００８菜豆晕疫病菌检疫鉴定方法１范围ＳＮ／Ｔ１５８６的本部分规定了进出境植物检疫中菜豆晕疫病菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊狊犪狏犪狊狋犪狀狅犻ｐｖ．狆犺犪狊犲狅犾犻犮狅犾犪）的检疫鉴定方法。本部分适用于进出境菜豆（犘犺犪狊犲狅犾狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊）、大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓

3、）等的植物种子中菜豆晕疫病菌的检疫和鉴定。２原理２．１病菌分类地位和重要特征菜豆晕疫病（Ｈａｌｏｂｌｉｇｈｔｏｆｂｅａｎｓ）是菜豆、大豆等豆科植物上的严重病害，该病的病原菌为菜豆晕疫病菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊狊犪狏犪狊狋犪狀狅犻ｐｖ．狆犺犪狊犲狅犾犻犮狅犾犪）。菜豆晕疫病菌属原核生物界（Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅｓ），薄壁菌门（Ｇｒａｃｉｌｉｃｕｔｅｓ），假单胞菌科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｃｅａｅ），假单胞菌属（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊）；单胞，杆状，直或微弯，革兰氏阴性，极鞭单生或多生，能运动，无鞘，无孢子，一般

4、大小（０．５μｍ～１．０μｍ）×（０．４μｍ～１．５μｍ），代谢呼吸型，化能有机营养型，接触酶阳性，精氨酸双水解酶阴性，氧化酶阴性。相关资料参见附录Ａ。２．２鉴定原理菜豆晕疫病菌的形态特征、生物学特性、生化特性、寄主范围、传播途径，以及分子生物学特征作为制定本检疫鉴定标准的依据。３仪器、用具———生物显微镜；———生物安全柜（或超净工作台）；———高压灭菌器；———小型电动粉碎机；———恒温培养箱；———离心机；———ＰＣＲ仪；———电泳设备；———凝胶成像系统；———其他常规实验室设备、器具及试剂。４主要

5、试剂除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。ＰＣＲ反应体系用水双蒸水。其他试剂比如各种溶液、缓冲液和培养基都是检测方法特有的，都应按附录要求准备。商品化试剂参见其使用说明。双氧水（３％），蛋白胨，酵母粉，硫酸镁（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ），蔗糖（Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１），磷酸氢二钾（Ｋ），琼脂，多聚蛋白胨，甘油，乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ），三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ），盐酸，冰乙酸，２ＨＰＯ４磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４），磷酸氢二钠（ＮａＨ２ＰＯ４），琼脂糖，溴化乙锭，犜犪狇ＤＮＡ聚合酶，１０×ＰＣＲ缓冲液，

6、ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌｅａｃｈ），溴酚蓝，二甲苯青ＦＦ，２０００ｂｐＭａｒｋｅｒ。１版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜１５８６．２—２００８细菌微量生化鉴定管：Ｄ甘露醇，戊二酸盐。生化鉴定试纸条：氧化酶试纸条。５检疫鉴定方法及步骤５．１病原菌的分离５．１．１植株分离方法５．１．１．１种植观察将待测的种子种植于温室或实验室的育苗钵中，每一育苗钵种植２粒种子，每份种子样品种植不少于３０００粒，生长环境适宜温度为２０℃～２５℃，相对湿度大于或等于７０％，种子出苗１周后开始观察。发生病害的典型症状为

7、种植期间有发病的幼苗，叶片表现为褪色花叶型，有萎蔫的情况。若观察到有典型症状的发生，则采集可疑病株进行病原菌的分离培养。５．１．１．２病叶中病原菌的分离用灭菌剪刀剪取病叶上的病斑，用含有效氯１％的次氯酸钠溶液表面消毒１ｍｉｎ，无菌水清洗三次，然后将其移至灭菌培养皿上，加５滴～６滴无菌水，用灭菌镊子将病斑夹碎，使病组织液溶于无菌水中。用接种环蘸取该液，在选择性培养基（ＭＳＰ，见附录Ｂ）上划线，每一处理做三个平皿（规格直径为９０ｍｍ，下同），２８℃恒温培养４８ｈ。５．１．２种子分离方法选取待测菜豆种子１５０ｇ，

8、用７５％酒精浸泡１ｍｉｎ，无菌水清洗三次，在无菌环境中晾干；将种子放入经灭菌处理的小型电动粉碎机中破碎（或将晾干的种子放入灭菌纸袋中，用锤子砸碎），之后装入一灭菌的大三角瓶中，加灭菌水２００ｍＬ，４℃振荡过夜；取浸出液进行差速离心，１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃沉淀，取上清液再进行８０００ｒ／ｍｉｎ的离心１０ｍｉｎ，之后将沉淀用２ｍＬ无菌水稀释；取稀释液１ｍＬ再进行系列浓度的稀释，分别为１／１０，１／１００