SNT2759-2011-栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７５９—２０１１栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪犮犪犿犫犻狏狅狉犪（犘犲狋狉犻）犅狌犻狊犿犪狀２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７５９—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研

2、究院。本标准主要起草人：封立平、刘会梅、王英超、厉艳、吴兴海、纪瑛、吴品珊。Ⅰ犛犖／犜２７５９—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法１范围本标准规定了植物检疫中栗黑水疫霉病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于栗黑水疫霉病菌寄主苗木、插枝等植物材料及其土壤和介质中的栗黑水疫霉病菌的定（参见附录Ａ）。２原理２．１分类地位栗黑水疫霉病菌［犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪犮犪犿犫犻狏狅狉犪（Ｐｅｔｒｉ）Ｂｕｉｓｍａｎ（１９２７），异名犅犔犲狆犺犪狉狅狊狆狅狉犪犮犪犿犫犻狏狅狉犪Ｐｅｔｒｉ，（１９１７）等］属卵菌门（Ｏｏｍｙｃｏｔａ），卵菌纲（Ｏｏ

3、ｍｙｃｅｔｅｓ），腐霉目（ＰｙｔｈｉａＬｅｓ），腐霉科（Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ），疫霉属（犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪）。主要危害寄主的根、茎，引发树木的多种病害，如栗树的黑水病（ｉｎｋｄｉｓｅａｓｅ），桃树的根腐病（ｒｏｏｔｒｏｔ），挪威槭的茎溃疡病（ｓｔｅｍｃａｎｋｅｒ）等。２．２鉴定依据以栗黑水疫霉病菌的寄主范围、在寄主植物上的症状、形态学特征、生物学特征为鉴定依据。３仪器设备及试验用具３．１生物显微镜（具油镜镜头）。３．２具透射光源的体视显微镜（最大放大倍数不低于５０倍）。３．３目镜和镜台测微尺。３．４高压灭菌锅。３．５电子天平。３．６超净工作台。

4、３．７光照恒温培养箱。３．８酒精灯。３．９医用手术剪、镊子。３．１０烧杯（１０００ｍＬ）。３．１１试管（直径：１２ｍｍ）。３．１２培养皿（直径：９ｃｍ）。３．１３载玻片、盖玻片。３．１４三角瓶（２５０ｍＬ）。３．１５量筒（５００ｍＬ）。３．１６ＰａｒａｆｉＬｍ膜或无色透明塑料袋。１犛犖／犜２７５９—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售４试剂与培养基４．１试剂４．１．１匹马菌素（ｐｉｍａｒｉｃｉｎ），氨苄青霉素（ａｍｐｉｃｉＬＬｉｎ），利福平（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ），制霉菌素（ｐｉｍａｒｉｃｉｎ），五氯硝基苯（ｐｅｎｔａｃｈＬｏｒｏｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎ

5、ｅ），制霉菌素（ｐｉｍａｒｉｃｉｎ）。４．１．２琼脂粉，玉米粉，大米粉。４．１．３７０％酒精。４．１．４棉蓝试剂。４．１．５无荧光显微镜物镜镜头油（犖ｄ＝１．５１６）。４．１．６永久封片剂。４．２培养基４．２．１基础培养基用于栗黑水疫霉病菌的保存和培养性状的观察、测定。采用胡萝卜琼脂培养基（ＣＡ）、大米琼脂培养基（ＲＡ）、玉米粉琼脂培养基（ＣＭＡ）。配方参见附录Ｂ。４．２．２半选择性培养基用于栗黑水疫霉病菌游动孢子的萌发、菌株的纯化、病原菌的分离及再分离。配方参见附录Ｂ。４．２．３豌豆琼脂培养基用于培养栗黑水疫霉病菌菌丝丛，来刺激孢子囊的产生。配方参见

6、附录Ｂ。５鉴定方法５．１症状检查仔细检查寄主植物的根颈部及茎基部，是否有根腐、颈腐、茎溃疡和坏死症状。观察围茎一周皮层是否出现变黑腐烂或有明显的棕色圆形病斑，散发酒糟味，潮湿条件下病部表面可长出白色菌丝。对可疑植物和繁殖材料的介质土送实验室用组织分离、植物材料诱集、土壤和介质诱集等方法进一步检验。５．２组织分离将病株置于大烧杯或大型玻璃容器中，在自来水流水下冲洗１ｈ～２ｈ，选取新鲜的根或茎病组织，在病健交接处切取０．５ｃｍ左右的小块，用７０％酒精消毒１ｍｉｎ，再用灭菌水浸洗１０ｓ～２０ｓ，用灭菌滤纸吸干水分后移至半选择性培养基，于２５℃～２８℃下培养５

7、ｄ。待长出菌落后镜检，菌丝体呈棉絮状，分枝，无隔多核，挑取菌丝尖端转移到基础培养基上２５℃～２８℃培养３ｄ。５．３植物材料诱集在诱集前把感病植株组织润湿，在１０℃～１５℃，黑暗条件下保存等待处理。选取未成熟的有机苹果或梨，在上面挖直径８ｍｍ的小洞，除去里面的果肉，每个苹果或梨以最多挖取６个小洞为宜。把感病组织切成１ｃｍ×２ｃｍ长，塞入洞中，洞的外缘应与苹果边缘平齐。如果感病组织非常细小，也可在苹果或梨上造成切口，把感病组织（如：树皮）插入切口中。把苹果或梨密封于塑料袋中，在室温下培养２犛犖／犜２７５９—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售４ｄ～６ｄ。观

8、察在洞或切口附近是否出现明显的棕色病变区，而且检查腐烂病变是否质地较硬，如果相符，则取洞口或切