SNT1418-2004鸭病毒性肝炎Ⅰ型病毒血清中和试验.pdf

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1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1418-2004鸭病毒性肝炎I型病毒血清中和试验SerumneutralizationtestforduckvirushepatitistypeIvirus2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和匡国家质量监督检验检疫总婿SN/T1418-2004oil台本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人:陈琅、黄新民、徐海聂、杨素、潘文波、

2、廖秀云。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/T1418-2004鸭病毒性肝炎I型病毒血清中和试验范围本标准规定了鸭病毒性肝炎工型病毒血清中和试验操作方法.本标准适用于检测血清中的鸭病毒性肝炎工型病毒抗体。主要用于鸭病毒性肝炎的诊断及病原鉴定、免疫水平的监测和流行病学调查。2缩略语下列缩略语适用于本标准。BME:Eagle'sBasalMedium细胞基础盐培养基2.2CPE:细胞病变。23DEK:鸭胚肾细胞。2.4DEL:鸭胚肝细胞。2.5DHV一工:鸭病毒性肝炎工型病毒。2.6FCS:胎牛血清。2.7MEM

3、:Eagle'sMinimalEssentialMedium细胞培养基。2日PFU:空斑形成单位。2.9TCID,::半数细胞培养感染量.原理病毒感染敏感的细胞单层后，可以在细胞单层上生长增殖，并能产生CPE，使感染细胞圆缩、坏死并形成空斑，血清中的特异性抗体能够抑制病毒在细胞单层上生长，血清抗体中和病毒的能力可以通过其阻止CPE产生的程度加以测定。本中和试验是应用固定病毒量稀释血清的方法，在DEL或DEK细胞单层上进行中和试验，用于鸭血清抗体的测定或病原的鉴定。4仪器设备高压蒸气灭菌器。4.2可调移液器。二氧化碳恒温培

4、养箱。:.;倒置显微镜。4.5除菌过滤器。SN/T1418-20045材料准备5.1鸭病毒性肝炎1型病毒。5.2抗鸭病毒性肝炎工型病毒的阴、阳性血清，使用前均以56℃灭能30min后备用。5.3受检血清按常规方法采血并分离血清，使用前均以56℃灭能30min后备用。5.4溶液的配制:见附录A,5.5细胞培养板:选用无菌的孔径为5cm平底带盖塑料培养皿，或96孔平底带盖塑料培养板。5.6其他仪器:如剪刀、镊子、平皿、烧杯、三角瓶、刻度离心管、注射器、吸头等以112kPa高压灭菌30min,烘干后备用。5.7DE工_细胞单层

5、的准备:参见第B.1章5.8DEK细胞悬液的准备:参见第B.2章。6血清中和空斑减数试验6.1病毒毒价测定及配备取DHV一工用维持液将病毒液作10倍系列稀释，每个稀释度接种三个培养皿，按7.2.4和7.2.5的方法进行试验。取每个稀释度的三个培养皿的空斑平均数，用Reed-Muench法计算病毒的PFU量，使用前配制成含200PFU/0.1mL的病毒悬液备用。6.2操作步骤6.2.1血清稀释及中和感作:分别取阳性血清、阴性血清、受检血清样品，用维持液作两倍系列稀释，每个稀释度加人等量病毒悬液，然后置37℃中和感作60mi

6、n，每个稀释度接种三个培养皿。6.2.2细胞对照:设三个培养皿的正常细胞对照，加入维持液。6.2.3病毒对照:设三个培养皿的病毒对照，将上述使用的病毒悬液稀释为100PFU/0.1mLe6.2.4取已长满DEL细胞单层的细胞培养皿，吸去培养液，用维持液清洗两次，将上述稀释及感作好的混合液移人细胞培养皿内，每个培养皿。.1mL，加盖后轻轻摇，使液体均匀分布于DEL细胞单层表面，然后置室温(200C-220C)感作30min.6.2.5每培养皿加人琼脂维持液3mL，加盖后，置370C,3%^-5%二氧化碳培养箱培养48h，取

7、出后用偏光源(或低倍倒置显微镜)直接观察空斑的形成情况，或用10%的福尔马林固定后用1%的结晶紫染色观察空斑，并记录形成空斑的数量。6.3结果判定6.3.1当细胞对照正常，阳性血清效价与原滴定的效价相差1个滴度以内，病毒对照的三个培养皿的平均空斑数误差在10PFU以内时整个试验有效。6.3.2出现50%空斑减数的血清最高稀释倍数为该血清的抗体滴度。微量血清中和试验7.1病毒毒价(TCIDsa测定及配备取DHV一工细胞适应毒用稀释液将病毒液进行10倍系列稀释，加入96孔培养板内，每孔50tL,每个稀释度接种八个培养孔，然后

8、每孔加人100川一的DEK细胞悬液，然后每孔补加稀释液50pL。加盖后，置37C,3%^-5%二氧化碳培养箱培养96h，取出观察并记录CPE，按Reed-Muench方法计算出病毒的丁CID;=，使用前配制成含200TCID;.,i50pL的病毒悬液备用7.2操作步骤7.2.1血清稀释及中和感作:分别取阳性血清、阴性