Bcl2基因过表达的骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤的实验性研究

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1、类号：R68单位代码：10159密级：公开学号：201353039硕士学位论文（同等学力人员申请硕士学位）中文题目：Bcl2基因过表达的骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤的实验性研究英文题目：ExperimentalstudyofBCL2geneoverexpressionofbonemarrowmesenchymalstemcellsintreatmentofspinalcordinjuryinrats论文作者：王洪义王洪义指导教师：屠冠军教授教授学科专业：外科学外科学完成时间：2017年12月12月中国医科大学硕士学位论文I中国医科大学硕士学位论文Bcl2基因过

2、表达的骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤的实验性研究ExperimentalstudyofBCL2geneoverexpressionofbonemarrowmesenchymalstemcellsintreatmentofspinalcordinjuryinrats论文作者王洪义指导教师屠冠军教授教授申请学位医学硕士培养单位第一临床学院教授一级学科临床医学二级学科外科学（骨）教授研究方向脊柱外科方向方向论文起止时间2016年4月—2017年12月12月论文完成时间2017年12月12月中国医科大学（辽宁）2017年12月IIIII摘要目的：脊髓损伤是严重的脊柱疾病

3、并发症，常导致损伤节段以下肢体的严重功能障碍，其发病率逐年上升。外源干细胞的移植为脊髓损伤的治疗提供了崭新思路。骨髓间充质干细胞（BMSCs）的自我更新和增值能力较强、来源广泛、分离培养简单，但是由于移植后的BMSCs在宿主体内成活率及转化率较低，因此限制了其广泛应用。Bcelllymphoma/leukemiagene2（Bcl-2）被认为是能够抑制细胞凋亡发生的抗凋亡基因，是调节细胞凋亡的基本成员，能对抗多种原因引起的细胞凋亡,。本实验通过构建大鼠Bcl-2基因过表达载体，转染BMSCs,将其移植入脊髓损伤大鼠的损伤部位，观察疗效。方法：1、培养和传代大鼠BM

4、SCs，使用倒置显微镜进行形态学观察，用流式细胞术检测细胞表面标志性抗原CD44、CD45和CD90。构建及鉴定Bcl-2基因慢表达载体，转染BMSCs，以获得Bcl-2过表达的BMSCs，使用RT-PCR和western-blot技术检测Bcl-2的表达量，使用MTT检测细胞的增值效率。2、健康雄性8周龄SD大鼠20只,随机分为4组,每组5只大鼠,采用分点注射的方法，在大鼠脊髓损伤建模手术完成后进行MSCs移植。分组情况为：A：假手术组（Sham组，n=5）；B：损伤对照组（SCI组，n=5）；C：空载体BMSCs治疗组（BMSCs组，n=5）：在损伤部位注射空

5、载体BMSCs；D:Bcl-2过表达BMSCs治疗组（Bcl-2+BMSCs组，n=5）：在损伤部位注射Bcl-2过表达BMSCs。所有的大鼠连续观察6周，每周记录Basso，Beattie和Bresnahan（BBB）评分，以评价大鼠四肢功能。在第六周评分结束后选取大鼠损伤阶段或与损伤对应得阶段进行切片，TUNEL法观察神经凋亡情况。结果：1、第三代细胞培养第十二天时，用倒置显微镜观察细胞形态，细胞胞体向胞核收缩，细胞呈双极或多极状，胞体缩小，细胞质少，折光性强，突起细长且相互连接交叉，为典型的神经元细胞形态。流式细胞仪检测BMSCs表面标记物结果显示：CD44

6、和CD90表达阳性，阳性率分为97.8%和99.9%，CD45表达阴性，阳性率为0.9%。2、Bcl-2过表达载体组的Bcl-2表达量明显高于另外两组。3、在培养第4、5、6天时，Bcl-2过表达载体组的BMSCs增值效率明显高于空载体对照组(P＜0.05)。IV4、SCI组、BMSCs组、Bcl-2+MBSCs组大鼠BBB评分在六周内逐渐改善，在第5、6周时，BMSCs组和Bcl-2+MBSCs组大鼠的评分均高于SCI组（P＜0.05），但是在第六周时Bcl-2+BMSCs组大鼠评分较MBSCs组高（P＜0.05）。5、第六周时，SCI组少见TUNEL阳性细胞，

7、Sham组、BMSCs组、Bcl-2+MBSCs组均可见TUNEL阳性细胞，分布于脊髓灰质和白质内，以白质为主。Bcl-2+MBSCs组阳性细胞数为17.09±3.87个/HP，BMSCs组为8.23±1.09个/HP，统计分析发现，Bcl-2+MBSCs组阳性细胞数高于BMSCs组，差异有统计学意义（P＜0.01）。6、SCI组损伤平面以下BDA阳性神经纤维最少，Bcl-2+BMSCs组BDA阳性神经纤维通过损伤平面数量最多。定量分析显示，SCI组、Sham组、BMSCs组、Bcl-2+BMSCs组为4.37±1.12%、18.76±1.98%、38.65±3.

8、01%、6