糖皮质激素通过调控KLHL3抑制WNK4泛素化降解

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1、分类号：R394单位代码：10159密级：公开学号：201520002硕士学位论文中文题目：糖皮质激素通过调控KLHL3抑制WNK4泛素化降解英文题目：GlucocorticoidinhibitsWNK4ubiquitinationbyregulatingKLHL3论文作者：秦琳指导教师：吕晶玉副教授学科专业：遗传学完成时间：2018年3月中国医科大学硕士学位论文糖皮质激素通过调控KLHL3抑制WNK4泛素化降解GlucocorticoidinhibitsWNK4ubiquitinationbyregulatingKLHL3论文作者秦琳指导教师吕晶玉副教授申请学位理学硕

2、士培养单位基础医学院一级学科生物学二级学科遗传学研究方向高血压病的分子遗传学论文起止时间2016年9月—2018年3月论文完成时间2018年3月中国医科大学（辽宁）2018年3月中国医科大学硕士学位论文摘要前言：WNK激酶(withnolysinekinase)属于丝／苏氨酸激酶家族，因该家族的激酶结构域缺乏与ATP结合的赖氨酸残基而得名，目前发现WNKl～WNK4共4个家族成员。其中WNK1的大片段缺失和WNK4的错义突变会导致一种罕见的常染色体显性遗传病—II型假性低醛固酮血症(PHAII)的发生，该病是肾脏离子转运异常所致。实验研究证实，WNK4特异性表达在远端肾

3、单位，它能够抑制远端肾单位的NCCT、ENaC、ROMK等离子通道蛋白的活性和表达。2012年通过外显子组测序方法，克隆了PHAII的另外两个致病基因，KLHL3和CUL3。他们是E3连接酶泛素降解复合物组分，KLHL3特异性结合并降解WNK4。研究表明，WNK4的致病性突变位于WNK4的酸性基序上，KLHL3主要是结合域的磷酸化位点S433的错义突变，上述突变直接抑制了KLHL3和WNK4的结合进而抑制了WNK4的降解，从而导致临床症状的产生。糖皮质激素(glucocorticoid，Gc)是由肾上腺皮质分泌的甾体激素，糖皮质激素的生理和药理作用有调节免疫、代谢、渗透

4、压、生长发育等。Gc通常通过经典的基因组机制发挥作用，即脂溶性的Gc可以与存在于细胞浆内的糖皮质激素受体结合，随后与靶基因启动子附近的糖皮质激素反应元件(glucocorticoidresponsiveelement，GRE)结合，进而调节基因的转录，抑制或增强基因的表达。近年来的研究发现，Gc还存在不依赖基因组途径的其它作用，称之为“非基因组作用”，可发生在红细胞、血小板上，也可以发生在真核细胞上。对于Gc的非基因组效应的分子机制，目前还不十分清楚，但研究表明，PI3K、蛋白激酶AKT、p38、PKC、离子通道、第二信使cAMP、IP3等与糖皮质激素信号转导有关。Gc

5、有醛固酮样作用，可作用于远端肾单位，促进水钠贮留。我们课题组前期工作鉴定了WNK4基因启动子区域的糖皮质激素反应元件，Gc可通过该GRE下调WNK4基因表达。然而，糖皮质激素是否还通过泛素化降解路径改变WNK4的功能尚不清楚。由于无商品化用于免疫沉淀的WNK4抗体，本研究转染HA-WNK4表达载体至HEK293细胞，糖皮质激素刺激后，HA抗体免疫沉淀，泛素抗体检测WNK4泛素化状态变化，随后糖皮质激素刺激HEK293细胞和M1细胞，定量PCR及Westernblot检测WNK4、KLHL3和CUL3基因及蛋白表达，Westernblot检测蛋白酶体抑制剂及糖皮质激素受体

6、特异性抑制剂作用下WNK4蛋白表达量，免疫共沉淀检测PKC激酶抑制剂作用下KLHL3和I中国医科大学硕士学位论文WNK4的结合，以揭示糖皮质激素对WNK4泛素化降解的作用及其机制。材料与方法：1、实验材料：HEK293细胞系、M1细胞系。2、实验方法：HEK293、M1细胞培养、基因瞬时转染、Real-timePCR检测mRNA表达、Westernblot检测蛋白表达、免疫共沉淀检测WNK4泛素化状态及WNK4与KLHL3结合力、统计学分析。结果：1、HA-WNK4表达载体转染HEK293细胞后，IP结果显示糖皮质激素刺激后泛素抗体杂交信号减弱（P<0.05）。2、Re

7、al-timePCR和Westernblot结果显示，糖皮质激素明显下调WNK4基因mRNA及蛋白表达水平（P<0.05），明显下调KLHL3基因mRNA及蛋白表达水平（P<0.05），而CUL3基因mRNA及蛋白表达水平均无显著变化。3、加入蛋白酶体抑制剂MG-132及糖皮质激素受体拮抗剂RU486后，WNK4蛋白量增加（P<0.05）。4、免疫共沉淀结果显示，加入PKC抑制剂后，WNK4杂交信号增强（P<0.05）。结论：1、糖皮质激素能够改变WNK4泛素化状态。2、糖皮质激素通过基因组机制下调KLHL3表达，并通过PKC代表的激酶路