电泳分析常用方法

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1、电泳分析常用方法 （一）醋酸纤维素薄膜电泳  醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5靏的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存。⒈材料与试剂醋酸纤维素膜一般使用市

2、售商品，常用的电泳缓冲液为pH8.6的巴比妥缓冲液，浓度在0.05-0.09mol/L。⒉操作要点    ⑴膜的预处理：必须于电泳前将膜片浸泡于缓冲液，浸透后，取出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液，不可吸得过干。⑵加样：样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定。对血清蛋白质的常规电泳分析，每cm加样线不超过1靗，相当于60-80靏的蛋白质。⑶电泳：可在室温下进行。电压为25V/cm，电流为0.4-0.6mA/cm宽。   ⑷染色：一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春红，糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂，脂蛋白则用苏丹黑

3、或品红亚硫酸染色。⑸脱色与透明：对水溶性染料最普遍应用的脱色剂是5％醋酸水溶液。为了长期保存或进行光吸收扫描测定，可浸入冰醋酸：无水乙醇＝30:70（V/V）的透明液中。 （二）凝胶电泳   以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广，介绍如下：⒈琼脂糖凝胶电泳的原理概述

4、琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的检测。⒉琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA＞直线DNA＞开环双链DNA。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA（球形）不能进入胶中，相对迁移率为0，而同

5、等大小的直线DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于0。⑴设备与试剂：琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有TBE（0.08mol/lTris·HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/lEDTA）和THE（0.04mol/l Tris·HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸钠，0.0018mol/lEDTA）。   ⑵凝胶制备：用上述缓冲液配制0.5％-0.8％琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加

6、热使之融化，冷至55℃时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5靏/ml，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脱凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。⑶样品制备与加样：溶解于TBE或THE内的样品应含指示染料（0.025％溴酚蓝或桔黄橙）、蔗糖（10％-15％）或甘油（5％-10％），也可使用2.5％FicoⅡ增加比重，使样品集中，每齿孔可加样5-10靏。   ⑷电泳：一般电压为5-15V/cm。对大分子的分离可用电压5V/cm。电泳过程最

7、好在低温条件下进行。   ⑸样品回收：电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况，对需要的DNA分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收，如电泳洗脱法：在紫外灯下切取含核酸区带的凝胶，将其装入透析袋（内含适量新鲜电泳缓冲液），扎紧透析袋后，平放在水平型电泳槽两电极之间的浅层缓冲液中，100V电泳2-3小时，然后正负电极交换，反向电泳2分钟，使透析袋上的DNA释放出来。吸出含DNA的溶液，进行酚抽提、乙醇沉淀等步骤即可完成样品的回收。其它还有低融点琼脂糖法、醋酸铵溶液浸出法、冷冻挤压法等，但各种方法都仅仅有利于小分子量DNA片段（＜

8、1kb）的回收，随着DNA分子量的增大，回收量显著下降。 （三）等电聚焦电泳技术   等电聚焦（isoelectricfocusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离