利用代谢组学研究隐甲藻葡萄糖耐受及DHA生物合成机制

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1、⑩太廖太豸ＴＩＡＮＪＩＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ中国第－所现代大学ＦＯＵＮＤＥＤＩＮ１８９５ｔ士学位文｜一级学科化学工程与技术：学科专业：生物化工作者姓名：：指导教师天津大学研究生院２０１７年４月利用代谢组学研究隐甲藻葡萄糖耐受及DHA生物合成机制MetabolomicsAnalysesofGlucoseToleranceandDHAAccumulationininCrypthecodiniumcohnii一级学科：化学工程与技术学科专业：生物化工作者姓名

2、：李兴锐指导教师：张卫文天津大学化工学院二零一七年四月摘要寇氏隐甲藻是海洋微藻生产DHA研究领域关注的热点，因其油脂及DHA含量高，且其他多不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的百分含量不超过1%。然而在隐甲藻生产DHA过程中葡萄糖抑制作用明显，因此选育耐受葡萄糖的隐甲藻对于改善DHA发酵能力具有重要的意义。本文首次通过定向驯化获得了一株高耐受葡萄糖的隐甲藻驯化株。驯化过程经历650天，驯化株在葡萄糖耐受性及油脂积累方面显著提高。在45g/L葡萄糖浓度条件下，比生长速率提高了2.8倍，平均倍增时间缩短了31.9%，葡萄

3、糖消耗速率提高了2.6倍，油脂含量提高了15.5%。代谢组分析结果表明驯化株相对于出发株，21个代谢物明显上调，甘油、谷氨酸、丙二酸及琥珀酸作为核心化合物和驯化株耐受性提高有关联。研究从全局水平理解并探索适应性机制，可为隐甲藻的育种提供重要的依据。另一方面，从代谢角度研究隐甲藻生长及DHA生物合成特性，对隐甲藻发酵生产DHA产业的发展具有重要意义。本文首先建立了隐甲藻间歇补料培养体系，所收获的生物量、DHA产量及DHA产率都分别达到42.9g/L，5.7g/L及47.5mg/L/h。从48h到72h油脂积累

4、显著，提高了27.5%，从72h到96hDHA积累显著，DHA在总脂肪酸的百分含量提高了17.8%。继而利用热图分析代谢组数据，结果显示G6P、GAP、AKG、OXA、DHAP可能和隐甲藻不同生长时期的表型相关。此外，氧气供应在工业微生物发酵中起着着举足轻重的作用，为了研究氧气供应对隐甲藻DHA生产的影响，本文考察了不同溶氧条件下隐甲藻DHA生产能力的变化。隐甲藻生长初期30%溶氧条件下的生长速率及葡萄糖比消耗速率都明显高于其他两种条件，最高的生物量及油脂产量是在20%溶氧条件下获得，分别是49.5g/L、

5、24.6g/L。隐甲藻稳定期30%溶氧条件下的DHA含量最高，提高溶氧水平有利于隐甲藻积累DHA。火山图分析发现生长及油脂合成的碳骨架及能量主要来自糖酵解途径及TCA循环；谷氨酸、肌醇等可能与隐甲藻对抗低氧胁迫相关；隐甲藻可能通过短链脂肪酸作为前体化合物合成脂肪酸；核糖-5-磷酸可能在隐甲藻DHA积累方面发挥着重要的作用。考察不同溶氧水平下隐甲藻在代谢水平的变化，建立溶氧与隐甲藻代谢物之间的联系，可以为今后隐甲藻大规模生产DHA提供参考信息。关键词：隐甲藻、DHA、驯化、代谢组、溶氧IABSTRACTCry

6、pthecodiniumcohniihasattractedgreatattentioninDHAproductionduetoitsabilitytoaccumulatelipidswithhighfractionandhighqualityofDHA.Ithasbeenreportedthatothertypesofpolyunsaturatedfattyacidsaccountforonlylessthan1%ofthetotallipidsinC.cohnii.However,peviousstud

7、iesshowedthathighconcentrationofglucosecouldinhibitthecellgrowthofDHA-producingC.cohnii.Soaglucose-tolerantstrainofC.cohniiwouldbeimportantforlarge-scaleapplication,whichincreasestheeconomicviabilityofthissystem.Inthisstudy,aglucose-tolerantC.cohniistrainw

8、asfirstlyobtainedbyAdaptivelaboratoryevolution(ALE)after650dayswithgraduallyincreasedglucoseconcentration.TheresultsshowedthatglucosetoleranceandDHA-richlipidsaccumulationintheevolvedstrainweresignificantimpr