西达本胺诱导PD-L1表达提高PD-1抗体在淋巴瘤中的应答率

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1、学校代码10459学号或申请号201522443911密级公开专业硕士学位论文西达本胺诱导PD-L1表达提高PD-1抗体在淋巴瘤中的应答率作者姓名：兰萱导师姓名：张明智专业学位名称：肿瘤学培养院系：郑州大学第一附属医院完成时间：2018年5月Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofdoctorChidamidemediatedPD-L1expressiontoimprovetheefficiencyofPD-1antibodyresponseinlymphomaByXuanLanSuper

2、visor:Prof.MingzhiZhangOncologyTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay2018西达本胺诱导PD-L1表达提高PD-1抗体在淋巴瘤中的应答效率研究生：兰萱导师：张明智教授郑州大学第一附属医院肿瘤科河南，郑州，450052摘要目的恶性淋巴瘤（malignantlymphoma,ML）是恶性造血系统肿瘤发生在淋巴结及免疫器官的总称，分为霍奇金淋巴瘤（Hodgkinlymphoma,HL）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkinlymphoma,NHL）两大类。恶性淋巴瘤在所有恶性肿瘤中排名第九

3、位，近年来随着生活生平的提高，其发病率呈逐年上升趋势。PD-1抗体作为有效的免疫治疗方法现已应用于多种恶性肿瘤[1-3]，其中对于复发难治性霍奇金淋巴瘤可达到87%总有效率[4,5]。但对于部分患者，PD-1抗体治疗效果较差，因此寻找一种药物用以提高PD-1抗体应答率显得迫在眉睫。去乙酰化酶抑制剂（西达本胺）通过调节组蛋白乙酰化水平控制基因表达，从而调节细胞免疫原性，提高抗肿瘤免疫应答。本实验通过探究体外西达本胺作用机制及体内西达本胺联合PD-1抗体疗效及机制，从而探索西达本胺对PD-1抗体在治疗恶性淋巴瘤中的影响。方法1）比较西达本胺诱导不同淋巴瘤细胞株凋亡能力。2）西达本胺

4、作用各细胞系8小时及24小时后，比较各细胞系总组蛋白，乙酰化组蛋白及乙酰化α微管蛋白的表达来明确西达本胺对不同淋巴瘤细胞系的作用机制。3）检测西达本胺作用不同时间对不同淋巴瘤细胞系表面PD-L1分子表达情I况的影响。4）选取免疫健全黑鼠（C57BL/6）建立EL4细胞系淋巴瘤小鼠模型，设4组，包括生理盐水空白对照组，单药西达本胺组，单药PD-1抗体组，西达本胺及PD-1抗体联合组，分别按相应药物剂量及间隔时间注射，每2周每组随机处死2只小鼠，分析肿瘤微环境中及脾脏中效应T细胞及抑制性T细胞的浸润数量。5）小鼠成瘤后按规定时间间隔及药物用量注射各组药物，观察每组小鼠死亡情况，每日

5、测量小鼠腋下肿瘤体积，给药3周后结束实验，处死全部小鼠，剥离所有肿块并称重记录，记录结束后使用SPSS软件分析各组小鼠肿瘤负荷变化及生存分析。6）三周后结束实验，处死全部小鼠，每组选取新鲜剥离的肿瘤组织福尔马林固定，石蜡包埋后通过免疫组化方法分析瘤体细胞中PD-1及PD-L1的表达情况。结果1）对于T淋巴瘤细胞系（EL4，HUT78，Jurkat及Karpas），随着西达本胺作用时间延长，细胞凋亡比例升高，而对于B淋巴瘤细胞系（LY8及Raji），随着药物作用时间延长，细胞凋亡比例变化不显著。2）选取西达本胺可显著诱导凋亡的四组细胞系（EL4，HUT78，Jurkat及Karp

6、as），加入相应浓度西达本胺分别作用8小时及24小时后，Karpas细胞系α微管蛋白乙酰化水平明显升高，EL4细胞系组蛋白乙酰化明显升高，而Jurkat及HUT78细胞系两组蛋白乙酰化水平均有不同程度升高，证明西达本胺通过提高细胞蛋白乙酰化水平发挥作用。3）西达本胺及空白对照组作用于四组细胞系（EL4，HUT78，Jurkat及Karpas）12小时，24小时及36小时后分析细胞表面PD-L1表达情况，其中EL4细胞系随药物作用时间细胞表面PD-L1表达水平增高，HUT78及Jurkat细胞系细胞表面PD-L1表达水平始终较低，Karpas细胞系细胞表面呈PD-L1高表达状态。

7、4）体内实验中，CD8+效应T细胞在应用药物7天后，脾脏组织中空白对照组效应T细胞数量最大，其次为西达本胺组，而单药PD-1抗体组数量最低；肿瘤组织中单药西达本胺组效应T细胞数量组多，其次为空白对照组，联合组效应细胞水平最低。药物应用21天后，空白对照组的脾脏组织及肿瘤组织中的II效应T细胞水平均降至最低，而两组单药组效应细胞水平相差不大，联合组的脾脏组织及肿瘤组织中的效应细胞水平升至最高。对于抑制性T细胞，应用药物7天时，脾脏组织中单药PD-1抗体组抑制性T细胞水平最高，而肿瘤组织中联合组