罗编09版生化分析实验课本

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1、生物化学分析实验南京罗大学喜生二命牛零科零学九学年院九生月物修化订学版系目录第一单元分光光度法实验方法……………………………………………………1实验一紫外分光光度法测定蛋白质吸收光谱曲线及含量………1实验二核黄素的荧光光度定量测定法……………………………4第二单元柱层析分离纯化实验方法………………………………………………7实验三离子交换柱层析法………………………………………7实验四凝胶渗透层析法…………………………………………11实验五DEAE—纤维素梯度层析法………………………………14实验六疏水层析（HIC）法………………………………………18第三单元亲和柱层析分离

2、纯化实验方法………………………………………22实验七亲和层析—分离纯化尿激酶……………………………22实验八亲和层析—分离纯化胰蛋白酶……………………………27实验九亲和层析—分离纯化胰蛋白酶抑制剂……………………32第四单元电泳检测分离纯化实验方法……………………………………………38实验十聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳………………………………38实验十一SDS—聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳（1）……………………43实验十二SDS—聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳（2）……………………47实验十三聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳…………………………52实验十四SDS—聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳……

3、………………56实验十五管式凝胶等电聚焦…………………………………………61实验十六单向火箭琼脂糖凝胶免疫电泳……………………………65实验十七潜水式琼脂糖凝胶电泳…………………………………68实验十八U型管密度梯度等电聚焦………………………………71实验十九聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白银染色法……………………74实验二十聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白铬银染色法…………………771第一单元分光光度法实验一紫外分光光度法测定蛋白质吸收光谱曲线及含量1、实验目的与要求：（1）、了解紫外分光光度仪的基本原理和使用方法。（2）、学习和掌握紫外吸收光谱曲线的制作方法。（3）、了解和掌握蛋白

4、质的定性、定量测定原理和方法。2、实验原理：蛋白质所含有的一些芳香族氨基酸（主要是苯丙氨酸，酪氨酸）具有共轭双键结构能够产生π→π﹡及n→π﹡类型的电子跃迁，因此能够在近紫外光区产生光吸收，并且在280nm波长处有一特征吸收峰。利用这一特性，通过对蛋白质紫外吸收光谱曲线的测定，可以进行定性分析。根据蛋白质溶液在280nm波长处的吸光度，在一定范围内与其浓度呈正比关系，可以进行定量测定。3、实验仪器与器材：3-1、实验仪器：（1）、紫外分光光度计（2）、混合器（4）、天平3-2、实验器材：（1）、可调取液器（2）、试管（3）、试管架（4）、吸管（5）、吸管架（6）、烧杯（

5、7）、滴管（8）、定容瓶（9）、洗耳球（10）、剪刀（11）、镊子（12）、玻棒（13）、骨勺（14）、称量纸（15）、吸水纸（16）、洗瓶（17）、标签纸23-14、试剂及配制：4-1、牛血清白蛋白标准品溶液的配制（1.0毫克/毫升）：准确称取牛血清白蛋白标准品50毫克，置于50毫升容量瓶中，然后加蒸馏水定容至刻度，溶解混匀后即为浓度1.0毫克/毫升的标准品溶液。4-2、牛血清白蛋白测试品溶液的配制（1.0毫克/毫升）：准确称取牛血清白蛋白测试品50毫克，置于50毫升容量瓶中，然后加蒸馏水定容至刻度，溶解混匀后即浓度为1.0毫克/毫升的测试品溶液。方法一、蛋白质的紫外

6、吸收光谱曲线测定与制作1-1、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的测定：采用2只光径1.0厘米洁净的石英比色杯，分别倒入蒸馏水4.0毫升和牛血清白蛋白标准品（或测试品）溶液4.0毫升于各比色杯中，以蒸馏水为空白溶液，调节仪器零点。样品溶液在250—300nm波长的范围内，每间隔5个nm波长依次测定，同时记录各波长蛋白质溶液的吸光值。在每次更换测定波长时均需要重新用空白溶液调节仪器的零点后，方能再测定样品溶液。对测定波长的范围和间隔大小，亦可根据不同样品的情况和要求加以确定（加大或缩小间隔）。1-2、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的制作：以测定的波长为横坐标，相对应的吸光值为纵坐标对应作

7、图。将图中各点用线连起来，即得到蛋白质的紫外吸收光谱曲线，其中最大吸收峰值所对应的波长即为该蛋白质最大吸收波长。方法二、蛋白质的紫外分光光度法含量测定2-1、牛血清白蛋白标准品溶液的配制：将已配好的牛血清白蛋白标准品（BSA）溶液（浓度为：1.0毫克/毫升），按表1稀释成六种不同浓度的标准品溶液。表1、六种不同浓度的标准品溶液的配制方法及结果表管号0123456样品BSA溶液(ml)0.00.51.02.03.04.05.0蒸馏水(ml)5.04.54.03.02.01.00.0总体积(ml)5.05.05.05.05.05.05.0实际