人源CBX7全长和部分片段的原核表达及蛋白纯化

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1、学校代码：10255作者学号：2150466硕士学位论文人源CBX7全长和部分片段的原核表达及蛋白纯化PROKARYOTICEXPRESSIONANDPURIFICATIONOFPARTIALDOMAINSANDFULL-LENGTHOFHUMANCBX7PROTEIN学科专业：生物化学与分子生物学作者姓名：吕缜一指导教师：陆昌瑞答辩日期：2018年1月15日东华大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入

2、有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。□保密，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于√不保密。学位论文作者签名：吕缜一指导教师签名：陆昌瑞日期：2018年1月18日日期：2018年1月18日东华大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：吕缜一日期：20

3、18年1月18日东华大学2015级硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名职称职务工作单位备注张惠展教授答辩委员会主席华东理工大学陈婷副教授答辩委员会委员东华大学曹张军副教授答辩委员会委员东华大学杨雪霞副教授答辩委员会委员东华大学张云龙讲师答辩委员会委员东华大学王露讲师答辩委员会秘书东华大学东华大学硕士学位论文人源CBX7全长和部分片段的原核表达及蛋白纯化人源CBX7全长和部分片段的原核表达及蛋白纯化摘要CBX7（Chromoboxproteinhomolog7），是存在于PcG家族PRC1复合体上的一个能够对细胞的增殖及衰老起到调控作用的转录抑制因子，与此同时CBX7还有着抑制

4、胚胎干细胞的分化、维持胚胎干细胞全能性等重要功能。通过有关学术论文可知，CBX7蛋白的表达量对胃癌、胰腺癌、直肠癌、胶质瘤等多种癌症和肿瘤有着一定的关系。在前列腺癌、卵巢癌和淋巴瘤中，CBX7蛋白起着促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的功能，所以CBX7蛋白的表达量增多可能导致这些癌症和肿瘤的恶化。而与此相反的是，在某些组织细胞中CBX7蛋白具有的是抑癌功能，如在甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌中，CBX7蛋白的表达量与肿瘤级别呈现负相关。然而直至现在，有关于CBX7蛋白的功能方面的研究的报道并不是很多，而有关于CBX7蛋白的结构、CBX7蛋白与同源蛋白之间相互作用以及CBX

5、7蛋白与核酸的结合位点等报道少之又少。截止到目前为止，尚未有对人源CBX7蛋白质全长及各个结构域的表达纯化及结构解析的文献报道。正因如此，我们希望通过对人源CBX7蛋白全长及多个可能存在功能结构域或存在蛋白核酸结合位点的区域进行表达纯化及分析，从而进一步加强对CBX7蛋白的了解，为CBX7蛋白的功能及其在人东华大学硕士学位论文人源CBX7全长和部分片段的原核表达及蛋白纯化类肿瘤、癌症方面的研究提供更多的理论依据。同时，也可以为CBX蛋白家族及PcG蛋白家族成员结构和功能的研究提供辅助性帮助。因为大E.Coil重组蛋白表达系统在蛋白质纯化过程中会导致部分蛋白形成不可溶的包含体

6、，而His-SUMO标签正好具有增强蛋白质可溶性的功效。除此之外，His-SUMO标签还具有易纯化、易切除、表达量高、且带有多种可选择的酶切位点的特性，所以在本次实验中，我们选用了His-SUMO-CBX7/domain的质粒构建形式构建。我们通过His-SUMO表达系统构建了包括CBX7全长序列在内的15个片段，这些片段根据多种蛋白质二级结构的预测和相关文献报道所设计，尽可能的覆盖到CBX7有可能存在的各个功能区域。接着，使用IPTG诱导表达的方法对构建成功的片段进行表达，筛选出不能表达或存在包涵体的区域；那么可以表达且可溶的蛋白质片段就可根据His标签对Ni的亲和性的原

7、理对片段进行Ni柱亲和纯化；随后，我们使用离子交换的方法对纯化效果不太好的蛋白片段进行进一步的蛋白纯化；得到较纯的蛋白后，使用ULP1酶切除His标签及SUMO，再次进行Ni柱亲和纯化后得到较纯的蛋白质单体；最后，使用分子筛纯化的方法进行最后一步纯化，得到单一的目标蛋白。在这个过程中，我们探索了不同蛋白质片段表达时所需的最适诱导温度及最适IPTG诱导浓度；探索了在不同条件、不同Imidazole浓度的洗脱下Ni柱亲和纯化的不同表现。以上的探索及操作，为后续的蛋白质结晶及蛋白的结构预测做好了相应的准东华大学硕士学位论