两型星形胶质细胞基因表达谱差异的初步观察.doc

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1、两型星形胶质细胞基因表达谱差异的初步观察作者：严美娟万明辉李春鹏夏春林【摘要】目的：研究不同型别星形胶质细胞的基因表达谱，比较1型和2型星形胶质细胞基因表达谱之间的差异，以进一步研究两者的生物学特性及其功能。方法：原代培养新生SD大鼠大脑皮质混合胶质细胞，经振荡和差速消化纯化培养1型星形胶质细胞（T1A）和2型星形胶质细胞（T2A）；应用基因芯片技术获取T1A和T2A的基因表达谱，并对两者的基因表达谱进行初步分析。结果：基因芯片上检测点4096个，共有差异表达基因267条，其中113条在T1A中高表达，1

2、54条在T2A中高表达。结论：本实验获得大鼠大脑T1A和T2A的基因表达谱，首次报道267条存在于T1A和T2A之间的差异表达基因。【关键词】星形胶质细胞；细胞谱系；基因表达谱；基因芯片随着研究的不断深入，人们已认识到胶质细胞不仅对神经元有支持、分隔绝缘、形成髓鞘、营养、修复和再生等多种功能。并积极参与神经元的活动，调节神经元的代谢和离子环境，对神经系统的发育和正常生理活动以及病理变化都具有重要作用。而且胶质细胞对正常脑发育、神经元的调控和中枢再生等方面所发挥的作用，已不亚于神经元本身。星形胶质细胞是中枢

3、神经系统中最主要的胶质细胞，根据发生分化谱系的不同可分为1型(type1astrocyte,T1A)和2型(type2astrocyte,T2A)星形胶质细胞，两者行使着某些不同的生物学功能[1~3]。目前有关T1A和T2A基因表达差异的研究尚未见文献报道。本实验应用基因芯片技术研究T1A和T2A基因表达谱及其之间的差异，这对认识不同型别星形胶质细胞的功能有极其重要的意义。　　1材料与方法　　1.1细胞培养取新生SD大鼠大脑皮质作原代混合胶质细胞培养，采用振荡法和胰酶差速消化法，结合使用富含血清培养基，分

4、别纯化培养T1A和T2A[4]。将大鼠大脑T1A作为对照组，T2A作为实验组。　　　　1.2基因芯片采用上海博星基因芯片责任有限公司芯片，芯片类型为BiostarR-40S。1型星形胶质细胞（对照组）样品编号T1A，Cy3标记，2型星形胶质细胞（实验组）样品编号T2A，Cy5标记。　　1.3细胞总RNA提取D-Hank’s液洗涤纯化培养的T1A和T2A，每10cm2细胞加入2mlTrizol试剂裂解细胞，使之充分溶解,分别转移入15ml离心管，加入氯仿，15℃~30℃放置3min，4℃12000g/min

5、离心15min,吸取上清分别至另一15ml离心管，加入异丙醇，15℃~30℃放置10min，4℃412000g/min离心10min,弃上清，加入75%乙醇，4℃8000g/min离心10min，弃上清，超净工作台内干燥沉淀，加入适量DEPC水完全溶解RNA沉淀，-80℃保存。　　1.4探针标记和杂交（1）预杂交：预杂交液95℃水浴变性2min，预杂交的玻片95℃水浴变性30s取出放入无水乙醇中30s，晾干后将变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5～6h；（2）标记探针

6、：分别在2个Eppendorf管中依次加入ddH2O23μl、逆转录引物5μl和T1A或T2A总RNA100μg，反应总体积50μl。混匀置70℃水浴10min，取出后迅速置冰，分别加入逆转录酶缓冲液10μl、DTT5μl和dNTPs4μl，在暗室中加入逆转录酶2μl和Cy3-dCTP（T1A管）或Cy5-dCTP（T2A管）3μl，混匀样品，室温2min，42℃水浴2h，加入标记试剂I4μl，65℃水浴10min后加入标记试剂II4μl，混匀，合并实验组和对照组，避光，真空抽干至50μl，DNA纯化柱纯

7、化DNA，加入标记试剂III8μl，真空抽干；（3）杂交：在抽干的探针管中加入6.5μl杂交试剂I，充分混匀至探针溶解，再加入6.5μl杂交试剂II，混匀备用。将预杂交的玻片取出并去除盖玻片，探针置95℃水浴变性2min取出后迅速置冰，玻片置95℃水浴变性30s取出浸入无水乙醇30s，将探针置于芯片上，盖玻片覆盖，置于杂交舱中并以Parafilm密封，42℃杂交箱内杂交18h，取出玻片并去除盖玻片，洗片剂洗涤后晾干扫描。　　1.5杂交结果检测和图像分析用ScanArray4000扫描仪扫描芯片，通过芯片图

8、像分析软件GenePixPro3.0对芯片灰度扫描图进行分析。收集Cy3和Cy5荧光标记信号值（基因点Cy3信号和Cy5信号各自的前景信号值减去它的背景信号值），将Cy5信号值小于200的以200取代以避免弱信号对实验结果的干扰。为校正Cy5、Cy3标记体系间的系统误差，均对实验数据进行均一化处理：计算每个有效基因点（Cy3、Cy5信号值皆大于200，或其中之一大于800；Cy5/Cy3在0.1~10之间）的Ri（=Cy5/C