5杂氮2脱氧胞苷对BGC823胃癌细胞株RIZ1基因去甲基化转录调控作用.doc

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1、5杂氮2脱氧胞苷对BGC823胃癌细胞株RIZ1基因去甲基化转录调控作用【摘要】目的:探讨5杂氮2脱氧胞苷(5AzaCdR)对人胃癌细胞系BGC823细胞株RIZ1基因的去甲基化转录调控作用及对细胞株生长增殖的影响,寻找胃癌治疗的新靶点.方法:使用3种不同浓度5AzaCdR干预胃癌BGC823细胞,甲基化特异性PCR(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测药物干预前后RIZ1基因的甲基化状态和RIZ1mRNA的表达;MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡的改变.结果:

2、未经5AzaCdR处理的BGC823细胞中RIZ1基因启动子区域CpG岛高甲基化,且RIZ1mRNA不表达,经2,5,10μmol/L5AzaCdR处理48h后,RIZ1基因启动子区域高甲基化得到逆转,细胞中均有RIZ1mRNA表达,相对定量值分别为0.509,0.716,0.831;3种浓度5AzaCdR处理BGC823细胞后,与对照组比较,细胞增殖速度出现不同程度减慢(P<0.05),随着浓度的增加其抑制作用增强;并显著抑制BGC823细胞生长周期,与对照组相比,G0/G1期细胞数增加,S期细胞

3、数减少,细胞凋亡率明显升高(P<0.05).结论:5AzaCdR能有效逆转胃癌BGC823细胞RIZ1基因的异常甲基化,从而激活因高甲基化导致RIZ1基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,抑制肿瘤细胞生长.【关键词】胃肿瘤肿瘤细胞,培养的5杂氮2′脱氧胞苷RIZ1基因DNA甲基化  0引言  抑癌基因失活是胃癌发生的重要原因,多种抑癌基因由于启动子区域CpG岛高甲基化而导致其失活已得到广泛证实.DNA甲基转移酶抑制剂5杂氮2脱氧胞苷(5AzaCdR)通过抑制甲基化酶,可使多种启动子区域高甲基

4、化的抑癌基因重新表达或表达增高[1].RIZ基因(Rbinteractingzincfingergene)是Buyse等[2]对可与Rb结合的蛋白质进行功能性筛选时分离出的,定位于人染色体1p36.能够产生两种交替出现的蛋白产物RIZ1和RIZ2.RIZ1基因是一种新型肿瘤抑制基因,在胃癌中对该基因的研究,国内少见报道.为研究胃癌中该基因的甲基化状态及CpG岛去甲基化后其转录活性的表达,我们应用5AzaCdR对BGC823细胞进行处理,观察RIZ1基因转录表达情况及细胞生物学特性的改变,从而为胃癌的临床治疗

5、提供分子水平依据.  1材料和方法  1.1材料人胃癌细胞株BGC823由兰州大学基础医学院病理学分子生物学实验室馈赠;RPMI1640(Gibco公司);5AzaCdR(Sigma公司),用PBS充分溶解后配制成1mol/L的母液,-20℃保存.EZDNAMethylationGoldKit(北京天漠科技开发有限公司),5AMV第1链cDNA试剂盒及PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程有限公司);Trizol试剂(Invitrogen公司);引物合成(大连宝生物工程有限公司),MTT及PI(Sigma公

6、司).  1.2方法  1.2.1细胞培养和干预将BGC823细胞用含100mL/L小牛血清、100ku/L青霉素和100ku/L链霉素的RPMI1640培养液,在50mL/LCO2浓度,37℃、湿度饱和的条件下培养.另配制含2,5,10μmol/L5AzaCdR的完全培养液.取传代后24h的细胞,分别加入含3种不同5AzaCdR浓度的完全培养液,根据实验要求,培养48,72h后回收细胞.对照组使用不含5AzaCdR的普通完全培养液.  1.2.2MSP法检测5AzaCdR干预前后BGC823

7、细胞中RIZ1基因甲基化状态取对照组和药物干预48h后BGC823细胞,应用饱和酚氯仿法抽提细胞基因组DNA,紫外分光光度计检测DNA纯度及含量.取20μgDNA,参照EZDNAMethylationGoldKit说明书对基因组DNA行亚硫酸氢盐修饰.以亚硫酸氢盐修饰后DNA为模板,使用甲基化扩增试剂盒分别用甲基化引物和非甲基化引物进行PCR扩增,所有PCR扩增均使用25μL反应体系.引物参考文献[3],甲基化引物:上游5′GTGGTGGTTATTGGGCGACGGC3′,下游:5′GCTATTTCG

8、CCGACCCCGACG3′,扩增片段为177bp,PCR反应条件:95℃变性10min,94℃变性30s,68℃退火45s,72℃延伸60s,共40个循环后,72℃延伸6min;非甲基化引物:上游5′TGGTGGTTATTGGGTGATGGT3′,下游5′ACTATTTCACCAACCCCAAGA3′,扩增片段为175bp,PCR反应条件:95℃变性10min,94℃变性3

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