5杂氮2脱氧胞苷对BGC823胃癌细胞株RIZ1基因去甲基化转录调控作用.doc

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1、5杂氮2脱氧胞苷对BGC823胃癌细胞株RIZ1基因去甲基化转录调控作用【摘要】目的:探讨5杂氮2脱氧胞苷（5AzaCdR）对人胃癌细胞系BGC823细胞株RIZ1基因的去甲基化转录调控作用及对细胞株生长增殖的影响，寻找胃癌治疗的新靶点.方法:使用3种不同浓度5AzaCdR干预胃癌BGC823细胞，甲基化特异性PCR（MSP）和逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测药物干预前后RIZ1基因的甲基化状态和RIZ1mRNA的表达；MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡的改变.结果:

2、未经5AzaCdR处理的BGC823细胞中RIZ1基因启动子区域CpG岛高甲基化，且RIZ1mRNA不表达，经2，5，10μmol/L5AzaCdR处理48h后，RIZ1基因启动子区域高甲基化得到逆转，细胞中均有RIZ1mRNA表达，相对定量值分别为0.509，0.716，0.831；3种浓度5AzaCdR处理BGC823细胞后，与对照组比较，细胞增殖速度出现不同程度减慢（P＜0.05），随着浓度的增加其抑制作用增强；并显著抑制BGC823细胞生长周期,与对照组相比，G0/G1期细胞数增加，S期细胞

3、数减少，细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）.结论:5AzaCdR能有效逆转胃癌BGC823细胞RIZ1基因的异常甲基化，从而激活因高甲基化导致RIZ1基因沉默的再转录，诱导该基因的表达，抑制肿瘤细胞生长.【关键词】胃肿瘤肿瘤细胞，培养的5杂氮2′脱氧胞苷RIZ1基因DNA甲基化　　0引言　　抑癌基因失活是胃癌发生的重要原因，多种抑癌基因由于启动子区域CpG岛高甲基化而导致其失活已得到广泛证实.DNA甲基转移酶抑制剂5杂氮2脱氧胞苷（5AzaCdR）通过抑制甲基化酶，可使多种启动子区域高甲基

4、化的抑癌基因重新表达或表达增高［1］.RIZ基因（Rbinteractingzincfingergene）是Buyse等［2］对可与Rb结合的蛋白质进行功能性筛选时分离出的，定位于人染色体1p36.能够产生两种交替出现的蛋白产物RIZ1和RIZ2.RIZ1基因是一种新型肿瘤抑制基因，在胃癌中对该基因的研究，国内少见报道.为研究胃癌中该基因的甲基化状态及CpG岛去甲基化后其转录活性的表达，我们应用5AzaCdR对BGC823细胞进行处理，观察RIZ1基因转录表达情况及细胞生物学特性的改变，从而为胃癌的临床治疗

5、提供分子水平依据.　　1材料和方法　　1.1材料人胃癌细胞株BGC823由兰州大学基础医学院病理学分子生物学实验室馈赠；RPMI1640（Gibco公司）；5AzaCdR（Sigma公司），用PBS充分溶解后配制成1mol/L的母液，-20℃保存.EZDNAMethylationGoldKit(北京天漠科技开发有限公司),5AMV第1链cDNA试剂盒及PCR扩增试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；Trizol试剂（Invitrogen公司）；引物合成（大连宝生物工程有限公司），MTT及PI（Sigma公

6、司）.　　1.2方法　　1.2.1细胞培养和干预将BGC823细胞用含100mL/L小牛血清、100ku/L青霉素和100ku/L链霉素的RPMI1640培养液，在50mL/LCO2浓度，37℃、湿度饱和的条件下培养.另配制含2,5,10μmol/L5AzaCdR的完全培养液.取传代后24h的细胞，分别加入含3种不同5AzaCdR浓度的完全培养液，根据实验要求，培养48,72h后回收细胞.对照组使用不含5AzaCdR的普通完全培养液.　　1.2.2MSP法检测5AzaCdR干预前后BGC823

7、细胞中RIZ1基因甲基化状态取对照组和药物干预48h后BGC823细胞，应用饱和酚氯仿法抽提细胞基因组DNA，紫外分光光度计检测DNA纯度及含量.取20μgDNA，参照EZDNAMethylationGoldKit说明书对基因组DNA行亚硫酸氢盐修饰.以亚硫酸氢盐修饰后DNA为模板，使用甲基化扩增试剂盒分别用甲基化引物和非甲基化引物进行PCR扩增，所有PCR扩增均使用25μL反应体系.引物参考文献［3］，甲基化引物：上游5′GTGGTGGTTATTGGGCGACGGC3′，下游：5′GCTATTTCG

8、CCGACCCCGACG3′，扩增片段为177bp，PCR反应条件：95℃变性10min，94℃变性30s，68℃退火45s，72℃延伸60s，共40个循环后，72℃延伸6min；非甲基化引物：上游5′TGGTGGTTATTGGGTGATGGT3′，下游5′ACTATTTCACCAACCCCAAGA3′，扩增片段为175bp,PCR反应条件：95℃变性10min，94℃变性3