探讨中药复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠治疗作用.doc

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时间:2018-08-31

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1、探讨中药复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠治疗作用摘要:目的应用人巨细胞病毒-核酸扩增(HCMVPCR)反应探讨中药复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠治疗作用。方法用小鼠尾静脉染毒法建立HCMV全身获得性感染模型,并用复方黄芪颗粒给小鼠灌胃治疗,然后应用HCMVPCR反应测定其内脏HCMVDNA阳性率。结果复方黄芪颗粒42.0,21.0g/kg组HCMVDNA阳性率明显低于模型组(P<0.05)。结论复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠有一定的治疗作用。关键词:人巨细胞病毒-核酸扩增(HCMVPCR);复方黄芪颗粒;人巨细胞病毒;

2、人巨细胞病毒感染小鼠模型人巨细胞病毒(HumanCytomegalovirus,HCMV)感染十分普遍。在妇产科,妊娠妇女孕早期原发HCMV感染可造成流产、早产、死胎、畸形,宫内生长迟缓、智力低下及听力损害等。目前,尚无对妊娠期HCMV活动性感染安全有效的治疗方法。本研究首次采用小鼠尾静脉染毒法建立HCMV全身获得性感染模型,并进行了复方黄芪颗粒对感染小鼠体内研究,应用HCMVPCR测定,证实黄芪颗粒组HCMVDNA阳性率明显低于模型组。现将本研究结果报道如下。1材料1.1标本收集和处理选取60只雄性小鼠,18~22

3、g,共分6组,每组10只,分别为复方黄芪颗粒大、中、小剂量组,阴性对照组,模型(病毒)组和阳性对照组。均采用小鼠尾静脉注射HCMV10-1,每只0.1ml,阴性对照组注射0.9%生理盐水,每只0.1ml,于染毒第2天开始治疗。大剂量组42.0g/kg,中剂量组21.0g/kg,小剂量组10.5g/kg,阴性对照组及模型(病毒)对照组均给蒸馏水,上述各组给药途径为灌胃,每天每只0.5ml,阳性对照组(更昔洛韦),实验结束时,取主要脏器做HCMVPCR。1.2HCMVPCR引物按文献[1],由山东省医科院生物医学研究中心

4、合成并纯化,引物序列:上游引物为5′-GATCCGACCCATTGTCTAAG-3′,下游引物为5′-GGCAGCTATCGTGACTGGGA-3′。2实验方法PCR检测标本中HCMV-DNA片段,每次扩增均设标准阳性和阴性对照。PCR体系25μl,其中含10×PCR缓冲液2.5μl,2.5mmol・L-1dNTP21μl,上下游混合物(各10mmol・L-1)1.5μl,TaqDNA聚合酶1μl,标本处理后取10μl提取物,无菌蒸馏水加至25μl,覆以30μl无菌石蜡油。反应按94℃1m

5、in,56℃1min,71℃1min,40个循环,最后于72℃保温10min,扩增物经2%琼脂电泳,溴乙淀染色,紫外灯下检测荧光条带,与阳性模板同一位置即为阳性。产物长度151bp。23结果上述结果表明,黄芪颗粒组HCMV-DNA阳性率明显低于模型组,与模型组比较有明显差异(P0.05),与阴性对照组相近,小剂量组与模型组相比虽无统计学意义,但其阳性率明显低于模型组。结果见表1,图1~2。表1复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠HCMV-DNA影响组别(略)4讨论诊断HCMV感染主要依靠实验室检查。利用特异抗HCMV单克隆

6、抗体的免疫组化技术,从病毒分离培养、病变组织、脱落细胞及外周血中直接检测到HCMV抗原,提示存在活动性HCMV感染,是诊断HCMV感染可靠的依据。因受灵敏度限制,检测HCMV抗原的免疫组化技术尚难于检出微量存在的病毒抗原,不能满足临床诊断要求,提高其灵敏度亟待解决[3]。原位免疫PCR技术[2],可用于检测微量存在的抗原,极大地提高了免疫组化检测的敏感性,我们利用其基本原理,建立了检测HCMV抗原的原位免疫PCR方法,用于诊断活动性HCMV感染。研究结果表明,本法检测HCMV感染的小鼠内脏组织细胞,可在感染后8h清晰

7、地检出阳性信号,与常规免疫组化相比阳性信号强,阳性细胞数多,显示高敏感度。HCMV感染细胞后可在细胞核内表达即刻早期、早期和晚期蛋白,即刻早期、早期蛋白通常在病毒复制前即可产生,其存在提示病毒呈活动状态[4]。本法采用pBV220质粒DNA片段作为指示元件DNA,它是与人基因组无关的DNA片段,与HCMV-DNA序列也无同源性。在检测中平行设置的阴性对照(正常小鼠内脏组织细胞、不加抗HCMV单抗),无阳性信号出现。同时我们用本法检测了收集到的5例因感染HCMV小鼠内脏组织标本,也呈阳性染色。且黄芪颗粒组HCMV-DN

8、A阳性率明显低于模型组,与模型组比较有明显差异(P0.05),与阴性对照组相近,小剂量组与模型组相比虽无统计学意义,但其阳性率明显低与于模型组,显示本法有较强特异性。本研究成功地将原位免疫PCR技术应用于HCMV感染小鼠模型诊断,显著提高了HCMV感染诊断敏感性,为中药复方黄芪颗粒治疗HCMV感染疗效评价提供重要的参考依据。参考文献:[1]Al

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