探讨中药复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠治疗作用.doc

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1、探讨中药复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠治疗作用摘要：目的应用人巨细胞病毒-核酸扩增（HCMVPCR）反应探讨中药复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠治疗作用。方法用小鼠尾静脉染毒法建立HCMV全身获得性感染模型，并用复方黄芪颗粒给小鼠灌胃治疗，然后应用HCMVPCR反应测定其内脏HCMVDNA阳性率。结果复方黄芪颗粒42.0，21.0g/kg组HCMVDNA阳性率明显低于模型组（P＜0.05）。结论复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠有一定的治疗作用。关键词：人巨细胞病毒-核酸扩增（HCMVPCR）；复方黄芪颗粒；人巨细胞病毒；

2、人巨细胞病毒感染小鼠模型人巨细胞病毒（HumanCytomegalovirus,HCMV）感染十分普遍。在妇产科，妊娠妇女孕早期原发HCMV感染可造成流产、早产、死胎、畸形，宫内生长迟缓、智力低下及听力损害等。目前，尚无对妊娠期HCMV活动性感染安全有效的治疗方法。本研究首次采用小鼠尾静脉染毒法建立HCMV全身获得性感染模型，并进行了复方黄芪颗粒对感染小鼠体内研究，应用HCMVPCR测定，证实黄芪颗粒组HCMVDNA阳性率明显低于模型组。现将本研究结果报道如下。1材料1.1标本收集和处理选取60只雄性小鼠，18～22

3、g，共分6组，每组10只，分别为复方黄芪颗粒大、中、小剂量组，阴性对照组，模型（病毒）组和阳性对照组。均采用小鼠尾静脉注射HCMV10-1，每只0.1ml,阴性对照组注射0.9%生理盐水，每只0.1ml，于染毒第2天开始治疗。大剂量组42.0g/kg，中剂量组21.0g/kg，小剂量组10.5g/kg，阴性对照组及模型（病毒）对照组均给蒸馏水，上述各组给药途径为灌胃，每天每只0.5ml，阳性对照组（更昔洛韦），实验结束时，取主要脏器做HCMVPCR。1.2HCMVPCR引物按文献［1］，由山东省医科院生物医学研究中心

4、合成并纯化，引物序列：上游引物为5′-GATCCGACCCATTGTCTAAG-3′，下游引物为5′-GGCAGCTATCGTGACTGGGA-3′。2实验方法PCR检测标本中HCMV-DNA片段，每次扩增均设标准阳性和阴性对照。PCR体系25μl,其中含10×PCR缓冲液2.5μl，2.5mmol・L-1dNTP21μl,上下游混合物（各10mmol・L-1）1.5μl，TaqDNA聚合酶1μl，标本处理后取10μl提取物，无菌蒸馏水加至25μl，覆以30μl无菌石蜡油。反应按94℃1m

5、in，56℃1min,71℃1min,40个循环，最后于72℃保温10min，扩增物经2%琼脂电泳，溴乙淀染色，紫外灯下检测荧光条带，与阳性模板同一位置即为阳性。产物长度151bp。23结果上述结果表明，黄芪颗粒组HCMV-DNA阳性率明显低于模型组，与模型组比较有明显差异（P0.05），与阴性对照组相近，小剂量组与模型组相比虽无统计学意义，但其阳性率明显低于模型组。结果见表1，图1~2。表1复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠HCMV-DNA影响组别（略）4讨论诊断HCMV感染主要依靠实验室检查。利用特异抗HCMV单克隆

6、抗体的免疫组化技术，从病毒分离培养、病变组织、脱落细胞及外周血中直接检测到HCMV抗原，提示存在活动性HCMV感染，是诊断HCMV感染可靠的依据。因受灵敏度限制，检测HCMV抗原的免疫组化技术尚难于检出微量存在的病毒抗原，不能满足临床诊断要求，提高其灵敏度亟待解决［3］。原位免疫PCR技术［2］，可用于检测微量存在的抗原，极大地提高了免疫组化检测的敏感性，我们利用其基本原理,建立了检测HCMV抗原的原位免疫PCR方法,用于诊断活动性HCMV感染。研究结果表明，本法检测HCMV感染的小鼠内脏组织细胞，可在感染后8h清晰

7、地检出阳性信号，与常规免疫组化相比阳性信号强，阳性细胞数多，显示高敏感度。HCMV感染细胞后可在细胞核内表达即刻早期、早期和晚期蛋白，即刻早期、早期蛋白通常在病毒复制前即可产生，其存在提示病毒呈活动状态［4］。本法采用pBV220质粒DNA片段作为指示元件DNA，它是与人基因组无关的DNA片段，与HCMV-DNA序列也无同源性。在检测中平行设置的阴性对照(正常小鼠内脏组织细胞、不加抗HCMV单抗),无阳性信号出现。同时我们用本法检测了收集到的5例因感染HCMV小鼠内脏组织标本，也呈阳性染色。且黄芪颗粒组HCMV-DN

8、A阳性率明显低于模型组，与模型组比较有明显差异（P0.05），与阴性对照组相近，小剂量组与模型组相比虽无统计学意义，但其阳性率明显低与于模型组，显示本法有较强特异性。本研究成功地将原位免疫PCR技术应用于HCMV感染小鼠模型诊断，显著提高了HCMV感染诊断敏感性，为中药复方黄芪颗粒治疗HCMV感染疗效评价提供重要的参考依据。参考文献：［1］Al