圆二色谱和荧光光谱法研究非酶糖基化抑制反应

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1、圆二色谱和荧光光谱法研究非酶糖基化抑制反应招洛彬吴京洪*中山大学化学与化学工程学院广州510275基金项目中山大学化学与化学工程学院创新化学实验与研究基金项目（批准号：03033）资助第一作者：招洛彬（1982年出生），男，中山大学化学与化学工程学院00级材料化学2班指导老师：吴京洪Email：ceswjh@zsu.edu.cn摘要本实验以葡萄糖和牛血清蛋白（BSA）系列混合物为研究对象；采用圆二色谱法和荧光光度法，对体外非酶糖基化反应进行研究，并观察了中药提取物－葛根素对体外糖基化反应的抑制作用。结果提示，圆二色谱法和荧光光度法对检测糖基化反应后产物各

2、有优势，中药葛根素对糖基化反应有着良好的抑制作用。关键词：非酶糖基化反应圆二色谱法荧光光谱法抑制剂葛根素氨基酸与葡萄糖的混合物加热后呈现褐色化，人们把这种蛋白质与葡萄糖之间发生的非酶反应称为蛋白质非酶糖基化（non-enzymaticglycation，下文简称糖基化），也曾称为Mailard反应。糖基化终产物(Advancedglycationend-products,AGEs)是体内蛋白质中赖氨酸的氨基部分与还原糖的羰基在无酶的条件下发生反应,形成Schiff碱,经Amadori反应重排后形成相对稳定的糖基化产物，并进一步与其他蛋白质、核酸大分子物质

3、以及脂类形成巨交联物,成为脂褐素的基本成分。脂褐素被溶酶体吞噬后,在细胞内堆积，干扰细胞正常代谢，影响细胞功能并产生细胞毒性作用，加速老化进程[1]。AGEs在血管壁沉积后与胶原蛋白发生交联，引起血管通透性增加和血管壁增厚，并可导致血管舒张功能障碍。目前临床检测的糖化血红蛋白和糖基化白蛋白都属Amadori类糖基化产物，是临床评估糖尿病患者检查前几天或几周内血糖平均水平的重要指标。AGEs具有棕色荧光反应的特点，因而可用荧光分光光度计测定其荧光值。最近研究表明：能干预体内糖基化反应的药物，它们一般都是通过降低体内AGEs水平、减少AGEs的交联、阻断AG

4、Es与受体的相互作用、抗氧化等途径来干预AGEs的合成、代谢和生物学效应[2][3]。　我国的传统医学在治疗糖尿病及其并发症方面有着悠久的历史，如何从中草药中寻找抑制蛋白质糖基化的有效成分是一项非常有前景的工作。与此同时，一种能快捷、准确追踪非酶糖基化反应的测试方法，对药物的筛选有着重要的意义。本实验拟利用圆二色谱和荧光光谱法追踪糖基化反应，并观测了中药提取物——葛根素对糖基化反应的抑制作用。1.实验部分1.1仪器与试剂J-810圆二色谱仪（Jasco）；二氧化碳细胞培养箱（HH.CP-T型01A，上海一恒科技有限公司）；荧光光谱仪（AmincoBowm

5、anSeries2，SpectronicUnicam）；牛血清蛋白（BSA）：相对分子量按65000计，配制成15.0g·L-1；葡萄糖（中国医药集团上海化学试剂公司，AR级）溶液：400mmol·L-1；葛根素注射液（广东省大日生物化学药业有限公司）；50mg·L-1，以50％的丙二醇作溶剂；NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液（PBS）：pH7.4，0.2mol·L-1。实验用水为二次蒸馏水。1.2蛋白质非酶糖基化将BSA与不同浓度的葡萄糖溶于pH7.4，10mmol·L-1locatedintheTomb,DongShenJiabang,defe

6、rthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame183的PBS中，室温放置过夜，0.25μm滤膜过滤，37℃恒温箱避光孵育，分别于3，6，9，12，24天后取出，待测。1.3葛根素干预试验将BSA与不同浓度的葡萄糖溶于pH7.4，10mmol·L-1的PBS中，加入葛根素进行干预试

7、验。未干预组为对照组，其余操作同上。表Ⅰ：总量为4.6ml的混合物的配制试剂编号缓冲溶液Na-H-PO40.2mol·L-1蛋白质BSA15g·L-1葡萄糖Glucose400mmol·L-1葛根素Puerarin50mg·L-1备注1．参照2.3ml1.53ml－－BSA自身荧光2.参照2.3ml－－0.04ml葛根素自身荧光3．参照2.3ml1.53ml0.115ml－无葛根素影响4．2.3ml1.53ml0.115ml0.04ml5．参照2.3ml1.53ml0.575ml－6．2.3ml1.53ml0.575ml0.04ml加大葡萄糖的用量7．2

8、.3ml1.53ml0.115ml0.08ml加大葛根素的用量时间条件：3，6，