(保健食品课件）三、增强免疫力功能评价的基本原理与方法

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1、增强免疫力功能评价及其检测方法①PV多糖的抑制肿瘤效率：将S180实体瘤接种至小鼠右腋皮下，给药及给蒸馏水(CK组)，连续10天，脱颈椎处死，剥离皮下瘤块，称瘤重，按[(对照组平均瘤重－实验组平均瘤重)÷对照组平均瘤重]计算抑瘤率。②PV多糖调节免疫功能：测定免疫调节作用的指标很多，本实验采用四个指标：包括T淋转、NK细胞、巨噬细胞的吞噬功能(MΦ)和α-干扰素浓度。动物或人体的免疫应答主要包括：机体非特异性免疫功能，即吞噬细胞的吞噬功能(巨噬细胞的吞噬功能(MΦ)，与抗原诱导的特异性免疫应答，即主要由淋巴细胞介导的细胞免疫与体液免疫。T淋转(T淋巴细胞转化实验)：T淋巴细胞在体外受

2、到非特异性有丝分裂原刀豆蛋白(ConA)的刺激后，能使T淋巴细胞活化与增殖，加入含有同位素氚的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)后，T淋巴细胞的DNA与RNA合成就利用此胸腺嘧啶核苷作为“原料”，因此合成的DNA与RNA均带有放射性同位素氚，经液闪仪检测淋巴细胞的放射性，即可了解淋巴细胞增殖的情况，也即淋巴细胞的转化率。一般转化率越高，免疫调节活性越强。(有丝分裂原可以刺激淋巴细胞活化与增殖，与抗原类似，区别在于有丝分裂原可以触发很多克隆的细胞活化，而抗原只能特异性的触发很少数克隆的细胞活化，简而言之，有丝分裂原是“广谱的”，而抗原是“特异性”的。NK细胞(NaturalKillercel

3、l)，能自发溶解多种肿瘤细胞与被病毒感染的细胞，因此称为为NK细胞。是一群不依赖于抗原刺激和致敏，也不需要抗体参与就能杀伤靶细胞的淋巴细胞，主要存在于外周血及脾脏中。测定原理：将胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)标记的靶细胞(肿瘤细胞，本实验采用小鼠淋巴瘤细胞株YAC-1)与淋巴细胞共同培养，靶细胞可被NK细胞杀伤，同位素便从被杀伤的靶细胞中释放出来，其释放量与NK细胞的活性成正比。通过测定靶细胞3H-TdR的释放率即可反映NK细胞的活性。巨噬细胞的吞噬功能(MΦ)，当异体物质鸡红细胞(CRBC)侵入机体后，巨噬细胞可通过聚集、识别和吞入消灭三个步骤完成吞噬过程。该方法是利用巨噬细胞对光滑

4、表面(如玻璃)具有粘附能力的特性。将鸡红细胞(CRBC)经腹腔注射入小鼠体内一定时间后，用生理盐水洗脱腹腔，将含有巨噬细胞的腹腔液滴于载玻片上，孵育一定时间后，冲洗掉无粘附能力或粘附能力差的细胞，固定染色，在显微镜下计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞的百分数和吞噬指数，据此判断巨噬细胞的吞噬能力。干扰素(interferon，IFN)是由病毒或干扰素诱生剂刺激人或动物有核细胞产生的一种糖蛋白。据其细胞来源、理化性质和抗原性不同可分为α、β和γ三种。具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等活性。IFNs的生物学作用主要有两个方面：抑制病毒在细胞内的增殖及肿瘤生长，增强巨噬细胞的吞噬功能(MΦ)，增强NK

5、细胞的活性。本实验主要测定了α-干扰素，测定方法，取血清用酶联免疫法测定。试验项目脏器/体重比值：胸腺/体重比值，脾脏/体重比值细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验，　迟发型变态反应体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测定单核－巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清试验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验NK细胞活性测定试验原则所列指标均为必做项目采用正常或免疫功能低下的模型动物进行实验试验检测方法实验动物推荐用近交系小鼠，如C57BL/6J、BALB/C等，6－8周龄，18－22g，雌雄均可，数量为单一性别，每组10－15只。剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个空白

6、对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天，免疫模型动物实验可适当延长。ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验－MTT法原理当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将MTT（一种淡黄色的唑氮盐）分解为兰紫色结晶而显色，其光密度值能反映细胞的增殖情况。仪器和材料RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、盐酸、异丙醇、MTT、Hank's液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4）200目筛网、24孔培养板，

7、96孔培养板（平底），手术器械、二氧化碳培养箱、酶标仪、721分光光度计、超净工作台ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验－MTT法试剂配制完全培养液RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10％小牛血清，1％谷氨酰胺（200mmol/L），青霉素（100U/mL），链霉素（100ug/L）及5×10－5mol/L的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2，即完全培养液。ConA液 用双蒸水配制成100ug/