解脲支原体中tetm基因的检测及临床应用评价.docx

《解脲支原体中tetm基因的检测及临床应用评价.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、解脲支原体中tetM基因的检测及临床应用评价解脲支原体中tetM基因的检测及临床应用评价中华皮肤科杂志1998年第3期第31卷论著摘要作者：朱慧兰　徐广坤　赖维　陆春　陈荣章0单位：510063广州，中山医科大学第三附属医院皮肤科［朱慧兰(现在广州市皮肤性病防治所)　徐广坤　赖维　陆春　陈荣章］近年来对解脲支原体(Uu)的耐药性研究表明，tetM基因是介导Uu对四环素耐药的唯一基因［1］。能否用检测tetM基因来反映Uu对四环素或四环素类其它抗生素的耐药性尚不清楚。本研究应用聚合酶链反应(PCR)方法检测tetM基因，并将其结

2、果与微量肉汤稀释法检测药物敏感性及临床疗效进行综合分析，以图明确tetM基因在Uu耐药性中的作用。一、材料与方法(一)材料：1.实验菌株：2株Uu标准菌株(血清型8TcS和血清型9TcR，由加拿大Albata大学Robertson教授赠送)，1株金黄色葡萄球菌标准菌株(由中山医科大学微生物教研室提供)，54株Uu是从我科STD门诊非淋菌性尿道炎(NGU)患者的尿道或宫颈拭子分离的临床株［2，3］。2.Uu选择性培养基：Uu液体培养基含1∶1牛心消化液、20%新鲜小牛血清、10%新鲜酵母浸液、0.1%尿素、0.002%酚红、2万

3、U/ml青霉素，pH5.6～6.0。Uu固体培养基是在液体培养基基础上加1.2%琼脂。以上试剂均由中山医科大学免疫学教研室提供。3.药物及主要试剂：标准品盐酸四环素(Tc)和强力霉素(Dx，Sigma公司)，美满霉素(Mc)(美国立达大药厂)。溶菌酶和蛋白酶K(Sigma公司)，TaqDNA聚合酶和限制性内切酶TaqⅠ(北京遗传所)。4.引物：序列为5′-TTATCAACGGTTTATCAGG-3′和5′-CGTATATATGCAAGACG-3′［4］，由中山医科大学遗传教研室负责合成。5.临床资料：从上述54例NGU患者中，

4、筛选单纯Uu感染引起的并首选四环素类抗生素(Dx或Mc)治疗的病例资料21份。治疗方案：Dx或Mc0.1每日2次，7～14天，停药一周后随访。疗效判断标准：①有效：症状、体征消失，Uu检查阴性，尿道或宫颈拭子涂片在1000倍显微镜下多形核白细胞≤4个；②无效：病情好转或无变化，但Uu检查仍阳性。(二)实验方法：locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinem

5、asters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame网址：www.jxdyf.com第3页，共4页1.微量肉汤稀释法检测药物MIC［3］：Tc、Dx及Mc标准品40mg制备成原浓度为4096μg/ml的药液，取96孔酶标板，每孔反应体积为200μl，每孔由25μl含不同浓度的药物(浓度梯度为0.25～512μg/ml)和25μl菌液(103ccu/ml)。每次试验时使用标准菌株和设置对照孔。混匀后置于

6、烛缸，37℃，孵育48小时观察结果。2.结果判定：按照NCCLS标准，Tc、Dx和Mc的敏感、中敏、耐药标准分别为MIC≤4μg/ml、MIC＝8μg/ml、MIC≥16μg/ml［4］。3.DNA的抽提：采用酚-氯仿抽提法。4.PCR扩增及酶切：反应总体积50μl，扩增条件为94℃25秒，50℃60秒，72℃60秒，共40个循环(PE-480型扩增仪)。取产物10μl用2%琼脂糖凝胶进行电泳，另取产物20μl用TaqⅠ酶消化，然后进行电泳分析。二、结果(一)PCR检测tetM基因的特异性、敏感性及重复性：用上述引物对TcRU

7、u和TcSUu及金黄色葡萄球菌标准菌株的DNA进行扩增，结果TcRUu标准菌株出现阳性扩增带，而TcSUu及金黄色葡萄球菌标准菌株没有扩增带(见图1)。扩增产物用TaqⅠ酶切后可产生三个特异性片段，其大小分别为190bp、130bp、77bp(见图2)。以10倍连续稀释的TcRUu标准菌株DNA(10ng～1fg)为模板，进行扩增，结果在10ng～102pg处可见阳性扩增带，而在102pg以下未见阳性扩增带，说明本方法敏感性为102pg，约相当于1.2×102个Uu。分别以TcRUu和TcSUu标准菌株的DNA为模板重复进行扩

8、增，结果如前MpGEM-7zf/HaeⅢ1：TcSUu，2：TcRUu，3：金黄色葡萄球菌图1　PCR引物的特异性MpGEM-7zf/HaeⅢ1：酶切结果，2：扩增产物，3：阴性对照图2　PCR产物的特异性述。(二)PCR检测tetM基因和微量肉汤稀释法检测MIC比较：54株