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《背角无齿蚌碱性磷酸酶的功能基团研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、背角无齿蚌碱性磷酸酶的功能基团研究;第21卷第4期1997年12月水生生物HYDROB10LOGICASINICA.Vo1.21.No4Dec..I997背角无齿蚌碱性磷酸酶的功能基团研究张洪渊(四Jil大学生物学系,成都610064)提要罗胜清Qc}.2}在一定条件下分别采用PMSFDTT,PCMB,NBSTNBSSUAN,BrAc及IBr等化学修饰剂选择修饰背角无齿蚌碱性磷酸酶的多种氨基酸残基,并测定其酶活力变化.结果表明,PMSF,NBSTNBS,suAN'D叮的修饰能显着抑制酶的活力,活力的降低与修饰剂的
2、浓度相关.BrAc,IAc,PCMB的修饰不表现对酶的抑制作用.作者初步认为,Ser,Lys和Trp残基是背角无齿蚌碱性磷酸酶的必需功能基团,部分二硫键对保护酶的催化功能也是必需的.关键词?矍兰!壁竺:壁苎兰堕:化学修饰苎塑垄塑些一一_探讨酶活性部位的功能基团,对研究酶的结构与功能及酶的催化机理具有重要意义.化学修饰法是目前探明酶活性部位功能基团的常用方法之一,已用此法探明多种动物不同酶的必需基团.对于碱性磷酸酶(AKP)的化学修饰,已对E,colit,牛肠,缢蛏文昌鱼…等的AKP作过研究对于河蚌中与珍珠质分泌相关
3、的AKP的功能基团研究尚未见报道本文用几种修饰剂对背角无齿蚌外套膜的AKP进行了研究,初步探讨了其功能基团.1材料和方法1.1材料及试剂背角无齿蚌(AnodontawoodianaHeude)取自成都郊区,蚌龄2w3龄.Sephadex(1厂1【)(】为Pharmacia产品,磷酸苯二钠为Merck产品各种化学修饰试剂苯甲基磺酰氟(PMSF)N-一溴代琥珀酰亚胺(NBS),对氯汞苯甲酸(PCMB),二巯基苏糖酵(D叮T),三硝基苯磺酸(TNBS),琥珀酸酐(SUAN),溴乙酸(BrAc)及碘乙酸(IAc)均为国产分
4、析纯或生化试剂级.1.2方法背角无齿蚌外套膜AKP的分离纯化及活力测定见前文【I≈外套膜经正丁醇抽提,硫酸铵盐析,Sephadex(1厂l【)(】凝胶过滤等步骤,分离出比活为l5O单位/mg蛋白的酶制剂.994年7月11日收到:】997年7月16日收到修改稿水生生物各种化学修饰剂修饰酶的基本条件:基质缓冲液由0.0lmol/L磷酸苯二钠溶液,005tool/L碳酸缓冲液(pH9.5),3%4一氨基安替比林溶液及蒸馏水按5:10:1:4比例配制,分别加入不同浓度(0.1或1.0mmol/L】的各修饰剂,并各加入0.1
5、mL提取酶液,在相同温度(40~C),相同pH值(pH9.5)条件下反应,测定随时间进程的活力变化2结果2.1几种化学修饰剂对背角无齿蚌AKP活力的影响取试管8只,各管加入10mL基质缓冲液,并分别加入PMSF,DTT,NBS,PCMB,BrAc,IAc,SUAN及TNBS溶液,使其终浓度为1.0mtool/L(PMSF为0.1mmol,L).再于各管中加入酶液0.1mU15ltg/mL),40~C反应8rain,然后加入2.0mL0.Imol/LNaOH溶液终止反应,测定各管的酶活力,以不加任何修饰剂的对照管的活
6、力为100,计算各管的相对活力(表1).襄1一些化学修饰剂对nxPr"~力的影响Tab1Theeffectsofson]echemicalmodifieronAKPactivity修饰剂PMSFDTTPCmNBSBrAcIAcSU^N"INBSModifier终浓度,mmol/L)0110lO10l01O10lOTerrrdnalcorg~entration相对活力766989893964438ReLativeactivity由表1可见,NBSTNBS和SUAN对AKP活力影响较大,PMSR几次之,而F'CMB,B
7、rAc和IAc影响很小.2.2PMSF对丝氨酸残基的修饰用0.1mmol/LPMSF修饰AKP,测定其失活的时间进程.结果表明,AKP的活力随修饰时间的延长而下降,在修饰20min后,活力下降一半,75min后完全失活(图1)如果以相对活力的对数对时间作图,得到一条直线(图2),表明AKP的失活过程为一级反应0l530456075时间Time(rain)囤1PMSF对AKP活力的影响开gITheeffectofPMSF咖aclivityofalkalinephosphatase一《V口妊嚣蛭囤2活力对数与时间的关系
8、Fig2Thenflationshipbetweenactivitylogarithmandtime.}^lJ:^1R姆智4期张洪渊等:背角无齿蚌碱性磷酸酶的功能基团研究349直线的斜率K为PMSF存在下AKP的失活速度常数,其数值为8.2×10.由此可见,丝氨酸残基是背角无齿蚌外套膜AKP活性部位重要的功能基团2.3NBS对色氨酸残基的修饰NBS可特异修饰
