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1、蛋白表达及菌体破碎问题我最近做蛋白表达时，蛋白表达量尚可，但就是在超声波碎菌时老是破不碎，后来做了相同条件下未诱导菌体进行破碎，发现很容易破碎，请教各位大侠这是怎么一回事啊？我的具体操作如下：培养两瓶200mlBL21（DE）plysS4小时，OD值0.9，对其中一瓶加入IPTG置37度诱导表达，IPTG终浓度为0.1mmol/l，另一瓶保持不变。诱导过夜，离心收获菌体，PBS洗涤两次后30mlPBS悬浮菌体，超声破碎30分钟（5秒、9秒），保证冰浴。然后对菌体裂解液分别以6000转、12000转离心，SDS-PAGE检测，发现目的蛋
2、白及菌体蛋白绝大部分存在于6000转沉淀中，上清中只有很少菌体蛋白（诱导后的）；而未诱导的则沉淀很少，且菌体蛋白大部分存在于上清中。请各位大侠帮小弟看看是怎么回事？是不是因为我的蛋白表达影响到了菌体细胞壁的结构了？可我的蛋白应该是包涵体表达啊，晕了！另外，在此前我做了大量的工作对菌体进行破碎，包括反复冻融，溶菌酶，盐酸胍（1-3mol/L，我不想用太高浓度的，尽管可以），DOC，SKL还有一些文献上介绍的一些裂解液配方，均无法破碎，我简直要无语了！！！！我最近在做蛋白表达.用的是PET和DE3.我也有一些问题不懂，希望可以和你共同探讨
3、学习。我表达的是分泌型蛋白，以下是我对你实验的拙见：1.诱导的温度是否可以在重新调2.超声的能量你用的多大的数值？是否在保证蛋白不变性的前提下，加大超声条件，超声时间适当可以延长。直到菌液清亮透明（黄油状）3.取溶菌酶作用的最佳浓度，同时在反复冻融的过程中要不时的调节pH到它可以发挥最大效力的数值4.破包涵体以及其它方法的过程怎么样？5.你用SDS-PAGE检测沉淀中的目的蛋白的分子量怎么样？6.蛋白表达影响菌体细胞壁的结构这一问题我也想知道1，诱导温度我以前用的20度，后来发现37度诱导表达量较高就采用了37度，但对破碎效果的影响我
4、正准备再试试。2，我用的超声仪属于前辈级机器（但保证能用），我也不知道具体功率的大小，只知道以往所用均为35%~45%，我用的是38%。超声时间我延长过，但诱导后的始终均是浑浊菌体悬液。甚至有时发生分层，估计是变性了。3，溶菌酶我用的效应浓度为1mg/ml，PH8.0，37度水浴1h，不管用。不知道你一般用多少浓度？溶菌酶能否与其它一些低浓度的离液剂或者去污剂联用？4，冻融法也用过，-20--37度，3次，不管用。再者就是一些裂解液，效果实在让人郁闷。5，SDS-PAGE检测沉淀中确实是目的蛋白，与全菌直接检测分子量相同。不知你对这一
5、点有什么想法？6，不知哪位大侠对蛋白表达是否会影响菌体胞壁结构这一问题不吝赐教？1.诱导温度的选择是以什么为标准（产量与表达蛋白的分离率）建议查文献核实2.菌液离心后上清做SDS-PAGE检测。看是否有目的蛋白，并收集。多次洗细菌沉淀并重悬细菌，超声只破碎离心收集的细菌细胞（防止菌液内已经有的蛋白在超声时与细菌一起超声变性发生分层）3.超声破碎细菌细胞,并纯化包含体后裂解释放包涵体，离心收集上清跑电泳看是否有目的蛋白，有收集，并收集包含体，对其处理如下（包含体的处理是我在园子里找到的，你在园子里搜索一下）10000r·min-1离心1
6、5min,弃上清。将沉淀用3mol·L-1尿素含0.2g·L-1TritonX2100反复洗涤处理得到纯化的包涵体,称重。包涵体用8mol·L-1尿素含10mmol·L-1二硫苏糖醇(DTT)溶解变性。复性:包涵体溶解变性后10000r·min-1离心15min,清除不溶性杂质。上清直接用复性液:50mmol·L-1Tris·Cl,1mmol·L-1EDTA,1mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF),不同浓度的氧化型谷胱甘肽(GSSG),还原型谷胱甘肽(GSH)稀释,使蛋白质终浓度不超过100mg·L-1,尿素终浓度为0.5～1.0
7、mol·L-1;在其他条件不变的情况下,分别改变GSSG和GSH浓度、温度及复性时间,PEG20000浓缩后,离心。测上清总蛋白质量,计算复性率,找出最佳复性条件。4.溶菌酶10mg/ml。在作用过程中菌液的pH会下将，所以最好多次重新调节pH>8(你查一下它的作用原理以及大肠杆菌的特性就知道）5.冻融法我们是10次，最少六次6.我感觉蛋白表达影响菌体细胞壁的结构的可能性较小，主要还是包含体的处理上（我也是新手）见笑了，供大家一起学习7.关于前辈级机器，如果前辈用可以，那么你应该在自己漠漠条件了，1.菌体破碎的检测指标:镜检,才可直观
8、知破全没有?2.反复冻融，溶菌酶，盐酸胍（1-3mol/L，我不想用太高浓度的，尽管可以），DOC，SKL还有一些文献上介绍的一些裂解液配方，均无法破碎?这些方法我都试过,菌是BL21（DE3）均无问题.你不成功的原因可
