全菌体蛋白提取方法.docx

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1、1.取单菌落至液体或固体培养基过夜培养2.取一接种环细菌至1.5mLEP管（可用2mL管子好超声），液体培养基视菌液浓度确定使用体积（菌量大致为1*10^9个）3.使用冰浴预冷的低盐PBS清洗细菌3遍离心条件：6000rpm，4℃，5min低盐PBS配制：1000mLNa2HPO4(12H2O)68mM1.4g(2.8g)NaCl3mM3.97gKCl9mM0.223gKH2PO41.5mM0.204gPBS尽量用枪头吸净4.每管加入1mL冰浴预冷的裂解液重悬细菌裂解液配制：5mLUrea7M2.1gThiourea2M0.762gCHAPS4%0.2gDTT1%0

2、.05g5.冰浴超声40%振幅，超2s停2s，超声4min注意避免气泡或泡沫产生6.14000rpm，4℃，离心30min，取上清7.加DNase、RNase消化残留核酸DNase使用的是TurboDNase每100μL加入1μLRNase10mg/mL每100μL加入2μL室温孵育30min10000rpm，4℃离心，3min，取上清8.Bradford法测蛋白浓度BSA标准品2mg/mL，做6个浓度梯度BSA标准品(μL)0510152025PBS(μL)504540353025PBS(μL)450终浓度(mg/mL)00.020.040.060.080.1各取

3、50μL加入200μL考马斯亮蓝(1：4)，室温孵育10min再各取混合液100μL至96孔板，酶标仪测量595nm吸光度，绘制标准曲线样品使用同样的方法测量吸光度，通过标准曲线计算蛋白浓度