分子生物学技术总结

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1、分子生物学技术总结姓名：梁潇班级：2班学号：1080800066一、核酸/蛋白分离技术1．DNA分离：破碎细胞→抽提蛋白质→DNA沉淀→乙醇洗除盐→琼脂糖凝胶电泳检测用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA是上解离下来，经苯酚、氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE缓冲液中即得到相对分子量高的DNA。2．RNA分离：抑制RNase→抽提去蛋白质→DNase消化DNA→甲醛变性琼脂糖凝胶电泳通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为

2、是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。3．蛋白分离：离子交换层析（1）层析法利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流

3、动相流出。改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。亲和层析（2）电泳分离：聚丙烯酰胺凝胶电泳　聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主

4、要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。应用：分离蛋白质和寡糖核苷酸二、基因克隆技术1．PCR：在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促和反应，PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分为三步：1）变性（92~95℃）2）退火3）延伸PCR各步骤的目的（1）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以

5、顺利进行。（2）变性--退火--延伸循环：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；　　③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。（3）PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟：用PCR仪扩增时,(变性.退

6、火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：①延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）②根据延伸速率推得，扩增1kb以内的DNA片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使PCR反应完全以提高扩增产量③继续72度延伸了10分钟除了可以使PCR反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。基因组PCR（无内含子基因）逆转录PCR由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”

7、，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。PCRRT-PCR（含有内含子的基因）通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5'和3'端RACE/GeneWalking（从部分基因获得全长基因）SMARTTM3’-RACE：利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡