限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法

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1、限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法，个人觉得总结得很好，特转贴供本供大家分享。酶切现问题，看内切酶说明书，相应试剂公司目录。不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，。可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基，同尾酶、同裂酶1.酶切不开或不完全1.1质粒问

2、题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂，1.2酶的问题：确认内切酶有效[很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。确认酶切效果不好，做标记，更换]。【题外话：用内切酶注意】a.内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶

3、会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。b.酶在使用时应置于冰盒中取酶。这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。c.酶使用完后应尽快旋紧盖子。有时我们可以发现，即使是-20

4、~-30度放置，酶仍然会冻结。个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。此外，有时由于操作不小心，冰盒上凝结的一些碎冰掉在酶管里了（我自己出现过两次，汗....）d.吸取酶时的tips。我们常用来取酶的tips都是最小的那种，适合2ul和10ul的枪，但tips通常有两种，一种是最常用的短的tips，用它取酶时，tips挨着酶液后，枪几乎是要插入管子，有时会在枪身上沾上酶液。因此，可能会产生污染。那么我

5、们必要非常注意动作，要么就换用另一种长的tips，专门去酶液用。1.3buffer问题。有些酶切的buffer中，添加了一些较为容易析出或溶解的成分[连接酶的buffer更是这样]，有时酶切的buffer没有完全融化时，buffer的浓度是不均一的。新的buffer先融化的部分，盐离子浓度要高，使用一段时间后，融化部分的离子浓度会变低。通常，这种影响不大，但如果是使用一些对离子浓度敏感的内切酶时就会出现问题。1.4双酶切的buffer选择：确认使用的是正确的buffer和反应温度[具体可以参考各

6、厂家提供的酶切buffer以及双酶切buffer的资料，其中，NEB的可以参见http://www.neb-china.com/cn/tech/re/double_digests.htm1.5酶切位点的甲基化影响：有时甲基化会影响酶切，常见的有XbaI、BclI等。甲基化主要分为Dam、Dcm和CpG甲基化等。如果是提取的质粒，质粒就会因大肠杆菌的Dam,Dcm被甲基化；如果是直接从哺乳动物细胞中提取的DNA，则部分DNA就会因CGmethylase的影响而被甲基化。一些酶切位点被甲基化后，酶切

7、会受影响。因此，出现酶切不开或不全时需要考虑甲基化的问题。甲基化通常出现在特定序列，以XbaI为例，仅当序列位5'-【TCTAGA】TC-3'时，XbaI的位点才会被甲基化，并非所有的XbaI位点都会出现甲基化。具体的列表可以参考http://www.biocolors.com.cn/en/gsxw_p.asp?N_id=12http://bio.takara.co.jp/BIO_EN/catalog_d.asp?C_ID=C0007http://www.neb-china.com/cn/tec

8、h/re/alteration.htm其中，克隆常用的酶切位点见下表：RestrictionEnzymeMethylationSequence&SiteMethylationTypeEnzymeActivityBlocked?AarI5'...CACCTGcG...3'CpartiallyApaI5'...GGGCCcG...3'CpartiallyApaI5'...GGGCCcWGG...3'DpartiallyBclI5-TGaTCA...3'ACompletelyBglI5'...GCC(