工业微生物 chap4 工业微生物学基本实验技术

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1、第四章工业微生物学基本实验技术工业微生物学是一门实践性很强的应用学科。它的建立和发展是以其实验技术和方法为基础的。微生物学实验技术和方法早已广泛地应用于现代生物工程的各个分支领域,与此同时，随着分子生物学技术的发展,各学科之间的相互交叉渗透,又进一步丰富了微生物学实验技术和方法的内容。现代的理工科大学本科生,除了要掌握广泛而扎实的工业微生物学基础理论知识外，还要训练和掌握微生物学实验的基本操作技能,同时也要了解或初步掌握先进的实验技术和方法,跟上迅速发展的现代生物工程学科前沿的步伐。本章根据理工科大学本科生的特点和学习任务，着重介绍工业微生物学的基本实验技术和方法,内

2、容包括：工业微生物的制片与显微技术、工业微生物的纯培养技术、工业微生物生理与发酵试验技术、工业微生物的检测技术等。第－节工业微生物的制片与显微技术微生物最显著的特性就是个体极其微小。我们人这双肉眼的眼力不足，必须借助于显微镜,才能观察到它们的个体形态及其内部结构。实际上,正是由于显微技术的建立,才使人类真正认识丰富多彩的微生物世界。因此，显微技术是一项很重要的技术,熟悉并掌握显微镜操作技术是研究微生物不可缺少的手段。现代的显微技术,除了用于观察生物体的形态和细微结构外,还可与计算机结合用于对生物体组成分的定性与定量分析等。本节要介绍的主要内容包括：(1)工业微生物显微

3、标本片制作技术：细菌染色标本片的制备,放线菌、酵母菌和霉菌显微标本片的制备,透射电镜、扫描电镜的微生物样品制备方法等；(2)常用显微镜的构造、性能及操作技术：普通光学显微镜的构造、性能和操作技术,相差显微镜的成像原理、构造和操作技术,暗视野显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜和扫描电子显微镜的成像原理和构造等。一、工业微生物显微标本片制作技术微生物显微标本的制作是显微技术的首个重要环节，直接影响着显微观察和研究微生物样品的效果。制备显微标本时，一方面应根据所使用显微镜的特点，采用合适的制片方法；另一方面应根据样品的特点,使被观察微生物样品的生理结构保持稳定，并通过各种手

4、段提高其反差。实验室最常用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察,因此本部分着重介绍光学显微镜用的微生物显微标本制备技术,包括细菌染色标本片的制备,放线菌、酵母菌和丝状真菌显微标本片的制备。同时也简单介绍用于电子显微镜用的微生物样品制备技术。(一)光学显微镜用的微生物显微标本制备1.细菌染色标本片的制备32由于细菌细胞小且无色透明,直接用光学显微镜观察时,菌体和背景反差很小，难以看清细菌的形态,更不易识别某些细胞结构,因此，一般都需要先将细菌进行染色,借助于颜色的反衬作用,以提高观察样品不同部位的反差,能更清楚地进行观察和研究。此外，某些染色法还可用于鉴别不同类群

5、的细菌,故细菌的染色是工业微生物学实验中重要的基本技术。染色前必须先对涂在载玻片上的细菌样品进行固定，固定的作用一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上,一是增加菌体对染料的亲和力。一般常用酒精灯火焰加热固定的方法，但应注意防止细胞膨胀和收缩，尽量保持细胞原形。(1)细菌的简单染色法细菌的简单染色法是利用单一染料,对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便,适用于细菌菌体一般形态和细菌排列方式的观察。常用作细菌简单染色的碱性染料有:草酸铵结晶紫、石炭酸复红、吕氏碱性美蓝等。碱性染料分子中，带正电荷的染色部分,很容易与带负电荷的细菌结合而使菌体着色。这样，经染色后的细菌细胞与背景形

6、成鲜明的对比,在光学显微镜下更易于识别。细菌简单染色的步骤为：烧片→涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→观察。(图4–1)A.加小滴水     B.涂成薄层   C.固定菌体 图4–1涂片制备过程(2)细菌的革兰氏染色法革兰氏染色法是细菌学中一种重要的鉴别染色法，是由丹麦病理学家ChristainGram发明创立的,后来再经一些学者作了某些改进。按照细菌对此种染色法的不同反应，可以把细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两大类,这是由两类细菌细胞壁的结构和组成不同所决定的。革兰氏染色法的基本步骤是:先用初染剂草酸铵结晶紫进行初染,再用媒染剂碘液媒染,然后用脱色剂乙醇处理,最后

7、用复染剂石炭酸复红或番红进行复染。经此法染色后,若细菌不被酒精脱色，能保持结晶紫与碘的复合物而呈现蓝紫色，则该菌称为革兰氏阳性细菌(G+)；反之，若细菌能被酒精脱色，而被复红或番红复染成红色,则称之为革兰氏阴性细菌(G-)。为了保证革兰氏染色结果的正确性,必须尽量采用规范的染色方法。被普遍采用的经Hucker氏改良的革兰氏染色法,其操作步骤为：制片→初染→媒染→脱色→复染→干燥→观察。(3)细菌特殊结构的染色法32细菌的鞭毛、荚膜和芽孢是细菌的主要特殊结构,要清楚地观察到这些结构，必须分别采用下述特殊染色法。(ⅰ)细菌鞭毛染色法细菌细胞表面是否长有鞭