组培过程中的玻璃化问题

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1、组培过程中的玻璃化问题在进行植物组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透时，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。这种试管苗生长异常现象就是P.Debergh（1981）首先命名的“玻璃化”（Vitrification）。是植物组织培养过程中所特有的一种生理失调或生理病变。    玻璃苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和森质素含量低、角质层、栅栏组织等发育不全，表现为光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能

2、不全，分化能力降低，所以很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材；生根困难，移栽后也很难成活。植物微体快速繁殖时玻璃苗的出现已成为一种很普遍的现象，该苗有时多达50%以上，严重影响繁殖率的提高，已成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍，造成人、财、物的极大浪费，所以试管苗下班化现象对植物组织培养的危害是相当严重的，也是亟待解决的问题。    （一）玻璃苗发生的因素    琼脂和蔗糖浓度与玻璃化成负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃苗的比率越低。Daniel G. W. Brown认为玻璃化可能是培养基渗透势不当所致。碳源不仅为芽的形成提供能

3、量，而且也起渗透调节作用，主要影响培养基的渗势（Salisbury等）。随琼脂浓度及纯度的增加，培养基硬度增加，从而影响其衬质势和水分状况。Debergh等研究表明，液体培养基的水势影响玻璃苗的形成，Ziv等认为只要降低培养容器中的相对湿度，就可以降低玻璃苗的比例。刘思颖等（1988）测得丝石竹玻璃苗叶片的水势约为正常苗的1.9倍，含水量为正常苗的2.09倍—2.21倍。自由水和高湿度可能与肉质嫩梢的形成有关。Davis等研究表明，液体培养是导致玻璃化的主要原因。可以断定，试管苗玻璃化可能是培养基内水分状态不适应的一种生理变态。    许多学

4、者证明培养基中BA浓度和培养温度与玻璃化成正相关，BA浓度越高或培养温度越高，玻璃苗比率越大。Debergh曾用14C-KT研究表明，随琼脂浓度的增加，KT利用率降低。同时也证明，随BA浓度的增加，玻璃化率增加。Bornman等用14C-BA研究表明，14C-BA的积累与不定芽分化和玻璃化是同步的。玻璃化苗的一个重要特征是叶脉明显加长，而GA3也有类似效应，也许GA3促进了细胞过度生工，从而导致玻璃化。生长素可以改变细胞壁的机械特性，使其具有更大的可塑性。    许多研究表明，非受伤的物理和化学协迫可以增加乙烯的合成。玻璃化被认为是一种非受伤

5、协迫条件下形态上的反应。玻璃苗苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性低于正常植株。在协迫条件下乙烯的快速合成，又通过抑制氨基环丙烷羧酸（ACC）酶的形成，对乙烯起反馈调节作用。通过改善气体交换防止玻璃化形成，可能与克服乙烯反馈抑制有关。一种与膜有关的过氧化物酶直接或间接掺入ACC合成乙烯。现已证明，IAA-氧化酶体系至少在乙烯合成的最后一步起作用。IAA含量降低将进一步通过IAA调节S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转化成ACC这一过程，从而降低了乙烯形成。Kevers等曾证明，对于玻璃苗，碱性过氧化酶同功酶活性增加，而酸性同功酶活性降低。但总可溶性过氧化物

6、酶活性增加，仅限于碱性提取物。有人认为，玻璃化的形成主要是膜的效应而与核酸无关。乙烯促进了叶绿素分解及细胞的畸形发展。乙烯处理破坏了膜的结构，随着细胞壁解离，细胞内积累有在量纤维素及泡状物质。可见，乙烯对玻璃化的影响，与改变组织的生理生化及纤维结构有关。Hakkart F. A. 等认为玻璃苗是培养瓶内气体与外界交换不畅造成的。密闭的封瓶口材料是导致玻璃化的原因之一（陈国菊等1992，李云等1996）。    培养基中高的含N量，特别是高的氨态N，也是导致玻璃化的因素。    有人发现不同部位的节段外植体与玻璃化有关，以留兰香基部节段所形成的

7、试管苗玻璃苗严重，中部茎段次之，茎尖最好（柴明良）；重瓣丝石竹中部茎段出现玻璃苗较多，基部茎段较少，茎尖没有（郭达初）。郭东红等（1989）认为瑞香茎尖外植体大小与玻璃化相关，茎尖外植体越小，出现玻璃苗比率越大。（二）玻璃苗发生的机理 Kevers等的试验表明，苹果砧木M7等的玻璃苗是由于过氧化物酶——吲哚乙酸氧化酶系统控制的乙烯过饱和的影响，并认为细胞激动素和NH4+离子的过剩是一种最初的胁迫，受胁迫的试管苗在乙烯过剩的空气中，抑制了乙烯的生物合成，结果降低苯丙氨酸解氨酶（PAL）和酸性过氧化物酶的活性，从而妨碍组织木质化，导致形成玻璃苗。

8、一种诱导协迫（过多的细胞分裂素和NH4+），可以通过酚含量的快速化调节不断增加的过氧化物酶活性。乙烯的大量形成又对其自身起反馈抑制作用，结果PAL和酸性过氧化物酶活