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时间:2018-08-06
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1、实验三细菌的抹片制做及染色【目的要求】(1)了解细菌简单染色法和革氏染色法的原理(2)掌握细菌抹片标本的制备及几种常用染色法的操作步骤【器材】(1)大肠杆菌、葡萄球菌、巴氏杆菌等18.24小时液体培养物和斜面培养物。(2)美蓝染色液、革兰氏染色液和瑞特氏染色液。(3)载玻片、接种环、酒精灯、染色架、蜡笔、吸水纸等。【原理】细菌个体微小,无色而半透明,折光性弱,在普通光学显微镜下观察活细胞时,只能见其大致轮廓。必须制成抹片标本,应用适当染料染色后,才能较清楚地观察到细菌的形态及某些构造。此外,还可根据细菌呈现出的不同颜色反应
2、而对其进行鉴别。【内容和方法】(一)细菌抹片标本的制备1.抹片根据所用材料不同,抹片的方法亦有差异(1)固体培养物用经酒精灯火焰烧灼灭菌后的接种环,蘸取无菌蒸馏水(无菌肉汤、生理盐水均可)一环于清洁无油脂的载玻片中央,再钩取细菌的固体接着物少许混于蒸镏水中,涂抹成直径为1—1.5cm大小的均匀菲薄的抹片。(2)液体培养物可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液1.2环,涂抹于玻片上即可。但应注意净管底Iili物摇匀,以免影响涂片效果。(3)组织涂片用灭菌的剪刀镊子取被检组织一小块,以其断面在玻片上压印或涂抹成适当大小的薄片。如为肝
3、脾组织,脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上。无论何种方法,切忌涂抹太厚,否则不利于染色和观察。2.干燥将抹片置于空气中让其自然干燥3固定固定的方法因材料不同而异:(1)火焰固定细菌培养物抹片,常采用火焰固定法,即将已干燥的抹片菌膜面向上,以钟摆速度在酒精灯火焰上通过数次(用手背触及抹片反面,以不烫手为宜)。(2)化学固定血液、组织等抹片常用此法固定,即以数滴甲醇滴加在玻片上,固定3.5min。抹片经固定后便粘附于玻片上而不易被水冲掉,并能改变细菌对染料的通透性,增加与染料的亲和力而更容易着色,同时多数细菌能被杀死。(二)
4、细菌的常用染色方法1.简单染色法只用一种染料进行染色的方法。染色后一般只能显示出细菌的外形、大小及排列。美蓝染色法在已固定的细菌抹片上,滴加美蓝染色液染i.2min,水洗,干后镜检。结果细菌呈蓝色。2、复杂染色法用两种或两种以上的染料进行染色的方法。结果使不同的细菌或不同的构造呈现出不同颜色,从而显示出细菌的特殊结构及染色特性。(1)瑞特氏染色法细菌抹片自然干燥后,滴加瑞特氏染液约1ml以固定标本,l-3min~,再滴加与染液等量的磷酸缓冲液或中性蒸镏水,轻轻晃动玻片或用口吹气,使之与染液混匀,经3-5min,待表面显金属
5、闪光,水洗,干后镜检。结果细菌吁蓝色,组织细胞等物呈其他颜色。(2)革兰氏染色法①在经固定后的抹片上,滴加草酸铵结晶紫染色液,染1.3min,水洗。②加革兰氏碘液媒染1.3min,水洗。③滴加95%乙醇脱色约30秒至1分钟至水洗。④用石炭酸复红或沙黄染色液复染1.2min左右,水洗,干后镜检。结果革兰氏阳性菌呈蓝紫色,革兰氏阴性菌呈红色。革兰氏染色法是微生物学中最重要和广泛使用的一种鉴别染色法,此法能将所有的细菌分成两大类:染成蓝紫色的革兰氏阳性菌和红色的革兰氏阴性菌。其原理主要是由于两类细菌细胞壁的化学组成和结构的不同。
6、革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖层很厚,且结构致密,当用乙醇脱色时,肽聚糖层孔径缩小,使结晶紫一一碘的复合物被截留在细胞壁内,所以细菌仍保留结晶紫的颜色。革兰氏阴性菌的细胞壁脂类含量高,乙醇抽提出脂质,导致通透性增加;且因肽聚糖含量低,结构疏松,其孔径在乙醇处理后仍保留足够的大小,致使结晶紫一一碘复合物可被洗脱出来,经复染后,则染上了复染液的红色。(三)细菌的特殊染色方法1.抗酸染色法(石炭酸复红—硫酸美蓝法)在经固定后的抹片上滴加石炭酸复红液,微加热染3min,水洗;再用硫酸美蓝液(美蓝2g溶于75ml水中,慢慢滴加浓硫酸25m
7、l混合即成)染约lmin,水洗,干后镜检。结果:抗酸菌呈红色,其他细菌皆为蓝色。2.荚膜染色法(碱性美蓝染色法)细菌抹片自然干燥后,滴加甲醇固定3—5min,用水轻微冲洗;再用碱性美盐染色液染2~3min,水洗,干后镜检。结果:荚膜呈粉红色,菌体呈蓝色。3.芽胞染色法在已固定的细菌抹片上,滴加石炭酸复红液,微加热至发生蒸气染5min,水洗;用95%乙醇脱色2min,水洗;再用碱性美蓝液复染1rain,水洗,干后镜检。结果:芽胞呈红色,菌体呈蓝色。4.鞭毛染色法(魏曦一张颖悟二氏改良染色法)(1)染液配制第一液:20%钾明矾
8、液(加温溶解)2Oml,5%石炭酸液50ml,20%鞣酸液(加温溶解)20ml。第二液:复红酒精饱和液。取第一液9份与第二液1份混合后立即过滤。滤液放置6h后使用,其效果更佳。(2)染色方法取变形杆菌6~8h血琼脂平板培养物,仔细从菌膜伸展最远处挑菌少许,轻轻放入盛有蒸馏水的试管中,经数分钟让其自行分散
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