实验二 细菌涂(抹)片的制备和革兰氏染色

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1、实验二细菌涂（抹）片的制备和革兰氏染色目的要求：1、掌握细菌抹片的制备方法和常用染色方法。2、认识革兰氏染色和抗酸性染色的反应特性。实验内容：1、 细菌抹片的制备：玻片准备：透明、洁净、无油渍。抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。干燥固定：火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。2、 细菌涂片的制备：讲解并示范涂片、干燥、固定的方法。3、 细菌常用染色方法：革兰氏染色法细菌抹片的制备革兰氏染色法：1.制片：取待检病料或细菌培养物常规抹（涂）片、干燥、固定。2.初染：滴加结晶紫，染色1-2分钟，水洗。3.媒染：用碘液冲去残水，并用

2、碘液覆盖约1分钟，水洗。4.脱色：用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时（20—30秒），立即水洗。5.复染：用复红液复染约2分钟，水洗。6.镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。革兰氏染色法原理：革兰氏染色法将细菌分为G＋和G-，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G＋细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、

3、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。G+菌与G-菌细胞壁的区别细胞壁革兰阳性菌革兰阴性菌强度较坚韧较疏松厚度21~80nm10~15nm肽聚糖层可达50层1~2层肽聚糖量50%~80%5%~80%糖类量约45%15%~20%脂类量1%~4%11~22%磷壁酸﹢﹣

4、外膜﹣﹢革兰氏染色法过程示意图革兰氏染色法动画革兰阳性菌革兰阴性菌革兰氏染色法革兰氏染色法动画实验报告：1、细菌抹片或涂片革兰氏染色的显微镜观察结果。2、革兰氏染色法的具体程序和注意事项。涂片干燥固定染色1~2min水洗、吸干镜检细菌的单染色细菌抗酸染色1.初染:用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。2.脱色:3%盐酸酒精脱色30秒~1分钟；用水冲洗。3.复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。