液相色谱的常见问题

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1、一.安装、启用和维护中重点注意事项  色谱柱既是液相色谱仪的最核心部件，价格相对昂贵，请牢记它是高档仪器中的高档部件，给它以足够的尊重和关怀。如避免强烈的碰撞和震动，尽管色谱柱从1米高的实验台掉落到水泥地上不至于100%会损坏，但50%的可能损坏你也承受不起。另外不要让柱床变干，避免在严寒环境受冻等。                                                  1.  柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配  色谱柱是消耗品，不是仪器原配的情况很多。上图表明柱连接的6种不

2、同方式（数字单位是英寸），如果两者类型不匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。接头比柱头深度长，不易拧紧而漏液；接头比柱头深度短，柱头内留有空隙而产生死体积，使谱带展宽和峰拖尾。2.  溶剂的匹配转换  色谱柱内保存溶剂和仪器系统内存留溶剂，如果和流动相不匹配，使用前需进行转换。特别是流动相含缓冲盐时，如保存溶剂是纯有机相或有机相比例高，直接将新柱接入使用，会导致缓冲盐在柱内结晶析出，最严重会将新柱永久不可逆地损坏。正相柱保存溶剂一般为正己烷，如果要转换成HILIC柱模式使用，由于正己烷和甲醇乙腈的互溶

3、性不好，转换中间需用二氯甲烷或乙酸乙酯过渡。3.  新柱使用前的平衡和老化  厂家出厂检验时一般都已进行过平衡，但色谱柱到最终用户时间不一，用户正式测定前最好对色谱柱再次平衡。最好的平衡兼老化一起进行的方法是运行几次完整的分析程序（包括进样），直到观察到峰形、保留时间和峰面积稳定为止。所谓“老化”是借用了气相的术语，目的是达到分析物在色谱柱以及整个液相系统流路中的吸附饱和。对某些特定的待测物，如分子量大于1000的，因扩散速度慢，老化时间相应要长，可采取大浓度进样或在同一个洗脱周期内连续进样多针的方式加

4、快老化。4.  pH使用范围  一般认为硅胶基质柱子的pH使用范围是2-8，这是很粗略的。硅胶类型、使用温度、硅胶表面所键合的固定相类型以及缓冲盐的不同，对此均有影响。硅胶比孔容小、键合密度大的填料pH耐受范围要大一些，如月旭公司的UltimateXB-C18色谱柱，选用的是高品质硅胶，加上高密度键合和双封尾，使pH耐受范围最大提高到10。磷酸盐缓冲盐渗透力强，有加快硅胶溶解的副作用，它的存在会降低pH使用范围。有机杂化硅胶以及硅胶表面涂覆杂化层的硅胶填料，有机质的存在使pH使用范围能到12以上，月旭公

5、司的Xtimate系列产品即属此类。5.色谱柱保存    短期保存(隔夜或隔周末)用所用的流动相（不含缓冲盐）保存为佳，以尽量减少下次使用的平衡时间。一般只建议在长期保存反相柱的时候用纯甲醇或乙腈，一方面纯有机相保存有最大限度减少键合相水解的作用，但纯甲醇（乙腈）又会将已水解而暂时吸附在柱内的键合相洗脱出去，使固定相流失进程加快，寿命缩短。纯有机相保存还有易挥发使柱床变干的缺点，使用80%左右有机相保存也属好的选择，且足以避免长菌。强烈建议在柱身上贴标签标明保存溶剂。  CN基柱在有机极性溶剂中柱床不稳

6、定（会导致柱床结构坍塌），适合在水相中低温保存。低温保存要确保不发生固定相冻结而损坏柱床。离子交换柱和水性SEC柱等适合保存在水溶液中的色谱柱，可加0.05%叠氮化钠溶液防止长菌。  正相柱，无论是短期还是长期，都推荐保存在所用流动相中二、柱压问题）以及容量因子k'相关，和柱压无关。但柱压（P）仍不失为a  上面是基本色谱分离方程式，分离度R和柱效（N）、选择因子（HPLC方法中的最重要参数之一，因为柱压反映了色谱柱的内部状况。现今能承受400bar压力的HPLC泵很常见，色谱柱如在远低于上限的压力下正

7、常运行，不需要我们重点关注；当柱压升高接近上限或者柱压有异常升高，往往意味着色谱柱出状况了，需及时进行维护和补救，严重时色谱柱就已报废了。本节将详细考察柱压问题并提出可行的解决方案。柱压方程    对填充色谱柱，柱压与黏度(η)、柱长(L)和流速(F)成正比，与填料粒径（dp）以及柱管半径（r）的平方成反比。K0是比渗透性系数，对填充床，其值约为0.001。通过此公式可近似计算出给定色谱条件下的理论柱压。只有当新柱实际测得的柱压和理论柱压相差很大，才能说柱压存在问题。  黏度(η)取决于流动相溶剂的选择

8、，为降低柱压，反相色谱中倾向于选择低黏度的乙腈，而不是高黏度的异丙醇。当然选择时还需考虑溶剂强度、极性、分析物的溶解度以及和分析物兼容性等。柱长（L）增加可以提高分离度（R），流速（F）提高能加快分离，但都会导致柱压上升，选择确定这些运行参数时，需综合平衡和折中。  填料粒径对柱压影响极大，dp降低一倍，柱压将增加4倍。UHPLC中采用的sub-2μm填料，柱压超过普通HPLC泵的400Bar上限很多。提高柱温因可降低黏度η，相应降低柱压。