稳定表达系统和瞬间表达系统的区别

《稳定表达系统和瞬间表达系统的区别》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、稳定表达系统和瞬间表达系统的区别稳定表达系统和瞬间表达系统是按目的蛋白表达的时空差异来分的；瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而丢失，目的蛋白的表达时限短暂。瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。大规模的瞬时表达技术是近年来的一个研究热点。已有报道能放大到100L反应器中生产重组蛋白，产量可达1~10mg/L。缺点是该方法技术条件要求高，如质粒的纯度、转染的效率等，而且瞬时转染得到的蛋白质产物保存时间较短，只能持续数天或2周。这是因为瞬时转染中，外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不与基因组染色体相整合，当细胞复制后，诱

2、导的性状消失。稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，可随细胞转录表达和传代，目的蛋白的表达持久、稳定。缺点是由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。有研究表明：把目的基因定点整合入染色体高活性位点有望能在较短时间内获得高表达细胞株。另外，近年来还报道了一些筛选高表达克隆的新方法，如影印法、固相筛选技术等，对缩短实验时间甚有帮助。CHO细胞的背景资料CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovary)，该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。全世界批准正式应用于人类疾病治疗

3、或疾病预防的基因工程产品约有三十多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产的，其余所有产品都是由CHO细胞和大肠杆菌生产的，大肠杆菌不能形成有活性的二聚体(如白介素2)，也不具有糖基化的功能(如EPO)，而CHO却具有如上的功能，因此CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主。另外CH0细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。CHO细胞的培养基类型：1.血清培养传统上CHO细胞的培养都是在DMEM／F12基础培养基中添加5~10的小牛血清(用于重

4、组蛋白)或胎牛血清(用于杂交瘤生产)单抗来完成的，血清除了供给细胞的营养成分外，还能促进细胞开始合成DNA，对细胞的增殖有很大的作用。实验证明，血清在细胞的体外培养中提供了细胞增殖所必需的生长因子。但是从重组蛋白生产的角度来看，出于Q和Qc的要求，每换一个批号的血清，都包含大量的验证工作，这就给生产带来很大的麻烦。另外血清来源于动物因此经常被污染，污染的血清往往导致细胞生长缓慢，蛋白产量下降，甚至导致细胞死亡。目前购自各大公司的血清虽能消灭细菌和所有支原体，但很难保证除去所有的病毒污染。血清的成分十分复杂，经研究表明，血清除含有促进生长的活性成分外，还含有一定的细胞毒

5、性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响细胞功能的表达血清复杂的成分也给基因工程表达产物的下游工作带来很大的困难。培养方法：①把培养瓶内的培养基用5ml的移液管转移到保存用的离心管里。②用培养液量的1/2的PBS（25ml‥2.5ml）清洗细胞表面（2次）。③再用培养液量的1/10的（25ml‥0.5ml）的胰酶冲洗细胞表面④再CO2培养厢里静置5分钟。（利用这段时间，准备好15ml的大离心管，并也好标签做好记号。）⑤物理方法处理，（敲击培养瓶两侧）是细胞脱离，再用显微镜确认是否完全脱离。⑥加入等倍量的（25ml‥5ml）培养基，充分冲洗培养瓶内表面，在连同细胞全部

6、转移到大离心管中。⑦离心分离（1,000rpm、4℃、10min）。（这段时间准备新的培养瓶，按照9/10的量（25ml‥4.5ml），加入培养液准备好。加入MTX的同时加入。）⑧离心分离后，为了避免沉淀细胞扩散到溶液里，要迅速将上清用吸管吸除。⑨加入培养液(DMEM+FBS,25ml‥5ml)，用移液管充分混匀细胞。⑩按1/10量，（25ml‥0.5ml）将细胞悬浊液注入新培养瓶中。?在CO2培养厢中37度条件下培养。培养液总量为5ｍｌCHO细胞培养：CHO细胞株置于RPMI1640培养基中，内含10%灭活小牛血清，青霉素100IU/mL，链霉素100IU/mL，置

7、于37℃，5%CO2的培养箱（德国Heraeus）中培养。每隔48h换培液，当单层培养细胞汇合以后，用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。将培养瓶中的CHO细胞按1×105/mL传代移入培养板中，待进入对数生长期后（约24h）加药。2.无血清培养利用含血清培养基生产蛋白制品有许多不利，如增加培养成本和污染机会，增加纯化难度和成本，增加产品质控指标。因此，大规模生产临床使用的生物制品，应尽量减少血清的用量，最好用无血清培养基取代。为此，应尽可能增加大规模细胞培养的接种密度，以缩短生长延滞期，提高细胞比生长速率。如果接种密度较低时，在培养开始阶段，可使用含