几种表达系统的比较

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1、万方数据万方数据万方数据生物技术通报尉础耐lMfo秽丑Hj胁伽2002年第2期3昆虫细胞表达体系除了以杆状病毒介导的昆虫细胞表达体系外，又开发比较新型的稳定转化系统，用于大量制备具有功能活性的目的蛋白博．9J。其表达水平高于哺乳动物细胞表达系统，并且在表达真核蛋白时。可以对其进行翻译后修饰，其优越性远超过细菌表达体系。3．1杆状病毒和宿主细胞在典型的杆状病毒载体中，外源基因由强大的多角体启动子所控制，以确保基因高水平转录，便于重组病毒的筛选，并且可将重组蛋白大量分泌至培养液中。常用的杆状病毒是A“柳抑pk∞缸加mf一∞多核型多角体病毒(A心JPv)

2、和家蚕(B0砌馏mD疵)多核型多角体病毒(BrIlNPV)。宿主细胞通常来源于双翅目昆虫，包括果蝇、蚊子。其中有S折聊池，2和从Dm∞加f如础妇咒qgⅡs￡盯中衍生的Kco来源于S∞如舭懈砌的Sf9细胞系是最常用的宿主细胞11⋯。3．2翻译后的修饰、加工重组蛋白在昆虫细胞中可以被糖基化，虽然糖基化位点与在哺乳动物细胞中一样，但寡糖链的性质有所不同，这可能是由于昆虫细胞不能将成熟糖链加工成哺乳动物细胞中那样的形式【“J。杆状病毒表达载体的翻译后修饰还有磷酸化、酰化、十六烷基化。曾有报道说，某些蛋白如乙肝表面抗原(Hb．sAg)，在杆状病毒中表达时还可

3、被十四烷基化。蛋白前体的水解也很重要，虽然哺乳动物的蛋白分泌信号在昆虫细胞中能被正确加工，但其它蛋白裂解位点在昆虫细胞培养物中不能够有效地或根本不能被识别【1⋯。3．3诱导表选杆状病毒表达体系能够方便、快捷地表达外源蛋白，但主要缺点是外源蛋白表达受病毒晚期启动子的控制，蛋白产量出现峰值时，细胞却由于病毒感染而即将死亡。￡概l鲫砷i_!口，，砌Mg口s￡∥金属硫因启动子是常用启动子，研究表明该启动子受到严格调控，当用重金属(如cd、cu)诱导时，可实现高水平转录。虽然Cd可能有毒性，但添加少量Cd诱导时可将表达量提高30～100倍。抗生紊如新霉素、潮

4、霉素抗性基因被用作选择性标记，可与外源基因进行共转染。杆状病毒表达体系能够高效表达目的蛋白。曾有报道说，每升感染的昆虫细胞中重组蛋白可达1～500rrd”J。一种抗E一选择素的sFv在该系统中表达时培养基上清可达到O．2～O．4mg／L水平，而在细菌表达系统中，无论在培养基上清中还是可溶性周质浸出物中，均未检测到该蛋白的表达。外源蛋白的表达取决于许多因素，优质培养和精心培养是必要的。要取得最佳结果，昆虫细胞必须富有活力并处于对数生长期。昆虫细胞对氧需求很大，搅动是必要的。但又是危险的，因为搅动过程对高度敏感的细胞形成很大压力。所要表达的基因本身的特

5、性是一个不容忽视的因素，有报道证明它能影响表达蛋白的产量114，”J。4哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统的主要优点是蛋白合成、加工和分泌的信号能被哺乳动物细胞准确而有效地识别。因为在哺乳动物细胞内质网中有完善的再折叠机构。也可以对蛋白分子进行糖基化，因此适于表达完整的大分子蛋白。载体的选择取决于外源基因导人哺乳动物细胞的方法和用来高效表达rⅢ酬A和合成蛋白的调控元件。有两种方法可将外源基因导人哺乳动物细胞：一种是病毒感染介导的，另一种是用化学方法(如脂质体法、磷酸钙法、D】丑砸沉淀法)和物理方法(如电转化法和微注射法)将DNA直接导人细胞中

6、。4．1转录、转译调控因素转录调控元件(如启动子、增强子)的效率在不同细胞系中有很大差异。启动子是影响外源基因表达效率的关键元件。因为细菌的启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以该系统调控元件大多分离自启动效率高而且生物背景清楚的病毒基因组。其中SWO、Ad~Ⅱ段LTR、CMV在cHO中效果较好。另一个转录元件是位于TATA框上游100～200bp处的增强子，能增强转录起始速率。许多基因的另一个元件是mRNA帽子上游多拷贝的Gc富含区。只有将顺式作用元件合理、有效地构建至表达栽体，才能达到高效表达。在哺乳动物细胞中表达的所有克隆基因都包含核糖体结

7、合位点和起始密码子。真核核糖体靠识别序列0CCGCcA／GCCAuGG“【16，”o启动翻译，1～万方数据2002年第2期吴丹等：几种表达系统的比较6位的核苷酸位置及十4位的G对克隆基因有效翻译都很重要。增强子可用于增强表达，许多增强子受细胞类型的限制。像S、珥O、CMv和劳斯肉瘤病毒的Ⅲt在许多类型细胞中都有活性，只是表达量有差异。在启动子确定的情况下，可通过引入指导前体lTlRNA合成的内含子序列、促进n很NA翻译的序列、拼接一个信号前导肽、解决密码子偏爱性等途径来提高表达水平闭J。4．2用于表迭的细胞系稳定细胞系的筛选比较费时。瞬时表达系统可

8、作为遗传工程构建是否正确的早期指征。基因工程嵌合抗体通常用COS细胞进行瞬时表达【“．i9J。病毒转染的Cm—K1细胞系通