扫描电镜与透射电镜样品制作(完全版)

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1、相关仪器的信息: 透射电镜:JEOL(公司)JEM-1230(型号)TEM,产地:日本 超薄切片机:Reichert-JungUltracutEultramicrotome,产地:奥地利扫描电镜:PhilipsXL30ESEM,产地:捷克 临界点干燥仪:HitachiHCP-2Criticalpointdryer,产地:日本 真空喷镀仪:Eiko IB5 ioncoater,产地:日本 包埋剂:SPI-CHEMSpurrresin,产地:USATEM样品包埋块制作有关注意事项一、取材:1、动作迅速:组织离体后,应将其快速放入固定液中,使组织细胞尽可能保持原来

2、的生活状态;2、减少损伤:选择锋利切割器械,减少牵拉或挤压组织;3、组织块大小:一般要小于1mm3。二、固定:固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞的过程,目的是尽可能保持细胞的原有生活状态,不发生位移,减少组织结构变化。固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面,应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中2、使用锇酸的注意事项9I通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液,使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。II锇酸为剧毒、极易挥发的试剂,必须在通风橱中操作,废液必须收集在密闭容器中

3、。第一次使用锇酸的同学,请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。三、漂洗:应彻底漂洗干净,减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。四、脱水:脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂,只有将生物组织中的游离水清除干净,包埋剂才能浸入组织。脱水过程中应注意:I逐级脱水而不能急剧脱水;II更换溶液时动作要快,特别是不要让组织离开溶液,否则会在组织内外产生气泡;III脱水过程中若要长时间停留或过夜,应放在70%脱水剂中,并在4℃保存。五、渗透:渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂,使细胞内外空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化

4、剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。包埋剂配制及使用过程中的注意事项:I所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的;II配制过程中应搅拌均匀,使用过程中应避免异物,特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂;9III配制好的包埋剂应密封保存,避免受潮。剩余包埋剂可密封并储存在-10—-20℃冰箱中,延长其使用期。9表1戊二醛溶液的配制终浓度1.01.52.02.53.04.05.00.2MPBS/ml5050505050505025%戊二醛水溶液/ml46810121620重蒸水加至/ml100100100100100100100表20.2M磷酸缓冲液(PBS)的配

5、制A液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液B液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液Na2HPO428.4g或Na2HPO4.H2O31.61g或Na2HPO4.2H2O35.6g或Na2HPO4.7H2O53.63g或Na2HPO4.12H2O71.64g加双蒸水至1000mLNaH2PO424.0g或NaH2PO4.H2O27.6g或NaH2PO4.2H2O31.21g加双蒸水至1000mL按下表比例混合A、B液后,配成0.2mol/L的母液,其中pH7.0为常用配方pH值5.86.06.26.46.66.87.07.27.47.67.88.0A液8.012.31

6、8.526.537.549.061.072.081.087.091.594.7B液92.087.781.673.562.551.039.028.019.013.08.505.30在缓冲液中加入葡萄糖,蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。表3多聚甲醛-戊二醛固定液的配制溶液名称剂量10%多聚甲醛溶液20ml0.2MPBS或二砷酸盐缓冲液50ml25%戊二醛水溶液10ml重蒸水20ml表42%锇酸溶液的配制试剂用量锇酸/g1重蒸水/ml509表5Spurr包埋剂配方药品名称硬配方软配方我们现用的配方VCD树脂10g10g10gDER7366g7g8gNSA26g26g

7、26gDMAE0.4g0.4g0.4g注:通过改变DER736的用量可以调节包埋剂的硬度。DMAE的用量则调节聚合反应的速度。9透射电镜样品制备程序:No.1包埋切片样品的制作过程样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜,然后按下列步骤处理样品:²倒掉固定液,用0.1M,pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min;²用1%的锇酸溶液固定样品1-2h;²倒掉固定液,用0.1M,pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min;²用梯度浓度(包括50%,70%,80%,90%和95%五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理,每种浓度处理15min,再用1

8、00%的乙醇处理一次,每次20min;最后过度到纯丙

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