g+ 细菌5 20121002

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1、杭州新景生物试剂开发有限公司区地址：浙江省杭州市西湖科技经济园西园八路2号H座2601邮编：310030电话：0571-56011203传真：0571-87983751革兰氏阳性细菌DNA试剂盒说明书产品组成革兰氏阳性细菌DNA试剂盒Cat.No.5次制备3302005核酸纯化柱2ml离心管溶菌酶BufferL1BufferL2BufferWA（浓缩液）BufferWB（浓缩液）BufferTE说明书5个5个60mg2ml2ml1.9ml1.5ml2.5ml1份产品储存与有效期溶菌酶请于2－8℃保存。其他物品如果储存于室温（15~25℃），可在两年内保持使用性能无明显变化；如果将产品储存

2、于2~8℃，可延长产品的有效期至两年以上。技术支持杭州新景生物试剂开发有限公司研发部：e-mail:technical@simgen.cn,电话：400-0099-857。产品介绍本产品适合从≤2.0×109细菌培养物中分离纯化总DNA。细菌经溶菌酶破壁处理后，被BufferL1溶解，再经BufferL2沉淀去除蛋白和细胞碎片，离心上清中的基因组DNA可结合到纯化柱上。经过BufferWA和BufferWB的洗涤，去除残留在膜上的蛋白与PCR抑制物后，基因组DNA用BufferTE洗脱，并可立即用于各种分子生物学实验。用户需自备的试剂与物品1．去离子纯水和无水乙醇。2．移液器及吸头（为避

3、免样品间的污染，推荐选用含有滤芯的移液器吸头）3．一次性手套及防护用品和纸巾4．台式小量离心机（可配离心1.5ml离心管和2ml离心管的转子）5．水浴锅和旋涡震荡器使用前准备1）如果离心机有制冷功能，请将温度设置到25℃。2）将水浴锅温度设置到37℃，并将BufferTE温育至37℃。3）向60mg溶菌酶中加入600µl去离子纯水配制成100mg/ml的溶菌酶溶液。注意：反复冻融溶菌酶溶液对其活性影响极大，如果一次配制了较多的溶菌酶溶液，应分装成小份于-20℃储存，解冻使用后的溶菌酶溶液如有剩余，应予以丢弃，不可再次冻存。4）根据试剂瓶标签上的指示在BufferWA和BufferWB中加

4、入无水乙醇，并在标签的方框中打勾作好“乙醇已加”的标记。杭州新景生物试剂开发有限公司www.simgen.cn仅供科研使用，请勿用于人体及动物的治疗或临床诊断。Ver.1杭州新景生物试剂开发有限公司区地址：浙江省杭州市西湖科技经济园西园八路2号H座2601邮编：310030电话：0571-56011203传真：0571-87983751操作步骤：1.用1.5ml离心管收集≤2.0×109细菌培养物，加入200µlBufferTE，旋涡震荡充分悬浮细菌。*1.0×109细菌相当于1mlOD600=1的细菌培养物中的细菌数量。*某些二价阳离子会抑制溶菌酶的活性，如果细菌培养基中含有二价阳离子

5、（如MRS培养基等），应在离心收集细菌后增加一次洗涤步骤：加入1ml蒸馏水，旋涡震荡悬浮细菌后12000rpm离心30秒，弃蒸馏水上清，再加入200µlBufferTE，旋涡震荡充分悬浮细菌。*细菌收集方法：a)悬浮培养的细菌：12000rpm离心30秒收集1－2mlOD600=1细菌培养物中的细菌，弃培养基。b)培养皿中的单菌落：在1.5ml离心管中加入200µlBufferTE,用接种环刮取菌落，将细菌洗脱在BufferTE中。2.加入100µl溶菌酶溶液，旋涡振荡约15秒混匀，37°C水浴30分钟。3.轻弹管壁使细菌悬浮起来，加入225µlBufferL1，旋涡振荡30秒混匀。*如

6、果从新鲜培养的细菌中提取DNA，可能会将细胞中的部分RNA一起分离纯化出来，但是RNA的存在并不影响PCR相关的实验。如果要除去RNA污染，可在本步骤中补加4µlRNaseA储存液（100mg/ml，本试剂盒不提供）。4.加入225µlBufferL2，剧烈摇晃离心管3－5次，再旋涡振荡30秒混匀。5.13000rpm离心2分钟。6.将步骤5中的上清液倒入到核酸纯化柱中（核酸纯化柱置于2ml离心管中），盖上管盖，12000rpm离心30秒。7.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500µlBufferWA,盖上管盖，12000rpm离心30秒。*确

7、认在BufferWA中已经加入无水乙醇。*滤液无须彻底弃尽，如果要避免粘附在离心管管口的滤液对离心机的污染，可将2ml离心管在纸巾上倒扣拍击一次。8.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入600µlBufferWB,盖上管盖，12000rpm离心30秒。*确认在BufferWB中已经加入无水乙醇。9.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。*如果离心