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时间:2018-08-04
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1、实验二血清清蛋白的分离及电泳鉴定一、实验目的1.掌握盐析法、凝胶层析、分离提纯蛋白质的原理和方法。2.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质的原理和方法。二、实验原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成,各行使其重要的功能。本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离,并用电泳技术观察蛋白质分离教果。1.蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素:水化膜和表面电荷。当维持蛋白质的稳定因素破坏时,蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出,蛋白质分子沉淀析出的方法很多,根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。盐析法是以中性盐如硫酸铵
2、((NH4)2SO4)等对蛋白质作用破坏蛋白质表面水化膜而使蛋白质相互聚集而析出。不同的蛋白质沉淀需要的中性盐浓度不同,在不同盐浓度下,蛋白质溶解度不同。球蛋白在半饱和状态下发生沉淀,而请蛋白在完全饱和状态下沉淀,利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来,此种盐析法称分段盐析。盐析后蛋白质沉淀经水溶后,最大特点是保持蛋白质生物学活性,因此,盐析法是研究蛋白质分子的结构和功能的最常用方法。除盐析法,有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、柱层析法和超速离心法等也是蛋白质分离的常用方法。2.水溶后的蛋白质含有高浓度中性盐,需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐,常用方法有:透析法脱盐和凝
3、胶层析法脱盐。本实验采用凝胶层析法脱盐,在葡聚糖凝胶柱中,蛋白质与盐的分子量不同,当样品通过层析柱时,分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒,沿着凝胶颗粒间的间隙流动,所以流程较短,向前移动速度较快,最先流出层析柱;反之,盐的分子量较小,可通过网孔而进入凝胶颗粒,所以流程长,向前移动速度较慢,流出层析柱的时间较后。分段收集蛋白质洗脱液,即可得到脱盐的蛋白质。3.蛋白质分离效果可用电泳方法检测,根据电泳图谱与未分离前蛋白质溶液和标准蛋白质比较,判断蛋白质的分离纯化的效果。电泳法是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝
4、胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中,于电场的作用下,向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动,使组分分离成狭窄的区带,用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。醋酸纤维素是指纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小,几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象,又因为膜的亲水性比较小,它所容纳的缓冲液也少,电泳时电流的大部分由样品传导,所以分离速度快,电泳时间短,样品用量少。血清蛋白各组分在pH8.6缓冲液的介质中所带负电荷的数量不同各组分的分子量大小不同,向正极泳动速度不同而分离开。三、实验器材和试
5、剂1.器材:10ml具塞刻度试管、离心管、小试管、5ml吸管、滴管2支、培养皿3套、醋酸纤维薄膜、点样器、电泳槽、电泳仪、1.0×20cm层析柱。2.试剂:(1)葡聚糖凝胶SephadexG-25:称10gSephadexG-25,加200ml0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液溶胀24小时。(2)生理盐水:称取分析纯NaCl0.89g,蒸馏水稀释至100ml。(3)饱和硫酸铵溶液:25℃时称取(NH4)2SO4约767g,溶解至1000ml蒸馏水中,至不能完全溶解为止,即为饱和硫酸铵溶液。(4)巴比妥缓冲液(pH8.6):称取巴比妥钠15.458g.巴比妥2
6、.768g,蒸馏水定容至1000m1。(5)氨基黑10B染色液:称取氨基黑10B0.5g,加入100ml漂洗液不断振摇,直到完全溶解。(6)漂洗液:取95%乙醇450ml,冰醋酸100m1,混匀后,用蒸馏水稀释到l000ml。四、实验操作(一)盐析沉淀蛋白质:取10m1具塞刻度试管1支,加入血清溶液2.5ml,缓慢加进等量饱和(NH4)2SO4溶液,充分摇匀,见有沉淀析出,静置10min,用双层滤纸过滤,弃去沉淀,取滤液。(二)凝胶层析脱盐:取已溶胀的SophadexG-25装柱(柱体积约150ml,注意一气呵成,无分层),待柱中液面降至凝胶面时,取1ml滤液加样
7、,待柱中液面再次降至凝胶面,加蒸馏水,用蒸馏水洗脱,流速为20滴/min,分管收集,每管10滴,每管流出液取出二滴用10%三氯醋酸检测,有沉淀出现者即为蛋白质洗出管,取对应沉淀最多的收集管用于电泳鉴定。继续用蒸馏水洗柱,流出液用1%BaCl2检测,直至无白色沉淀出现后,洗柱完毕关闭出口。(三)醋酸纤维薄膜电泳鉴定蛋白质分离效果:(1)取醋酸纤维薄膜一片(4×8cm),在薄膜无光泽面距一端1.5cm用铅笔划一线作点样位置,将薄膜浸入pH8.6巴比妥缓冲液中,待完全渗透后取出用滤纸吸干表面水分。(2)点样:用点样器蘸蛋白质透析液印在点样线上一侧,另一侧蘸血请作对照用。
8、(3)电泳
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