克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用

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1、克隆性基因重排在淋巴瘤诊断中的应用ClinicallySuspiciousLNBiopsyMorphologywithIHCIfnecessary,MolecularDxCytogenetics/FISHEvaluationoftheSuspiciousLymphNodeCarcinomav.LymphomaFNAWithFlowCytometrySuspectLymphomaCarcinomaCLLSuspectLymphoma,NegativeorNon-diagnosticWorkupforPrimaryD

2、iagnosisStagingandTreatmentFISHTreatmentNCCNNHLLymphomaGuidelines（5-10%）分子和细胞遗传学异常抗原受体基因的克隆性重排与类型相关的染色体异常简要原理检测方法应用和策略注意事项淋巴细胞表面受体IG：IGH（14q32)IGL(2q12)(22q11)TCR:TCRα14q11TCRβ7q32TCRγ7p15TCRδ14q11.2IG和TCR基因结构及重排过程胚系可变区恒定区胚系D-J重排V-D-J重排转录与拼接各区片段数多重排的多样性抗体多样

3、性IGHIGKIGLTCRATCRBTCRGTCRDV664338464768D277656546798J655611354淋巴细胞发育过程中基因重排顺序IG:H重排κ:IgH/κκ缺失λ：IgH/λTCR:：TCR：TCR淋巴瘤中基因重排形式——克隆性重排不同的淋巴细胞相同的重排形式淋巴细胞单克隆性增生淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标克隆性重排的检测方法Southern杂交PCR法特异性探针：胚系的特征性片段外另一不同大小的片段Southern杂交优点：敏感性较高可靠性高缺点：DNA量多（

4、10ug)新鲜组织操作复杂时间长、成本高放射性同位素逐渐被PCR方法替代．PCR法原理:VDJ重排后相互靠拢，用适当的引物可扩增出重排片段新鲜、冻存、石蜡、显微切割或细胞学标本，不受DNA片段的影响，仅需要少量的DNA，时间短，敏感性高，是目前最常用的克隆性重排的检测方法。引物的选择原则引物位置：PCR产物长度<300bp(最好在100－300bp）离连接区的距离>10-15bp引物本身的长度<25bp精确地将所有VDJ基因片段捡出家族性引物或通用引物不同的组合具有互补性，提高阳性率引物数目和同源性之间平衡该协作

5、研究由47个研究所组成7个网络和一个病理panel。它由分子生物学、免疫学、血液学、病理学等领域的专家。1998.6-2002.7，12次国际性会议。主要目的：（1）开发和标准化PCR实验操作和PCR引物（2）评价和应用该标准化方法BMH4－CT983936的欧洲BIOMED－2协作研究设计了一套完整的引物和方法用于IG和TCR基因重排的克隆性分析，共有14管97对引物IGH（A,B,C,D,E5管）IGK（A，B2管）IGL（1管）TCRB（A，B，C3管）TCRG（A，B2管）TCRD(1管)VanDonge

6、nJJMetal.DesignandstandardizationofPCRprimersandprotocolsfordetectionofclonalimmunoglobulinandTcellreceptorgenerecombinationsinsuspectlymphoproliferations:reportoftheBiomed-2concertedactionBMH4-C98-3936Leukemia2003;17:2257-2317所有引物采用相同的扩增条件和检测方法，并具有很高的敏感性和特异性

7、，已被推荐为可疑淋巴组织增生性疾病克隆性分析的标准方法，试剂已商品化http://www.invivoscribe.com/PCR产物分析方法克隆性重排判断基本原则：条带在期望的碱基大小范围内；一条或两条带宽不超过1mm,边缘整齐；多克隆性：无特异性条带，弥散带或梯状带聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)-异源双链分析+-2.毛细管电泳基因扫描（genescan）单克隆性细胞产生一个或两个尖的峰，多克隆为多个小峰，呈Gaussian分布。（本课题组曾用两种方法分析180管皮肤淋巴瘤的TCR基因重排，两者的符合率为96.

8、7%,在TCRB用genescan方法稍敏感，在TCRD用PAGE更特异。）对照的设立阳性对照阴性对照内对照:3个病例的内对照b-actin均为阳性-+-+-+-+-+-+FR2FR3ATCRG1TCRG2TCRB1TCRB2对照的设立－＋－＋－＋－＋－＋－＋2007-01-04controland1克隆性基因重排的应用诊断与鉴别诊断谱系确定分期克隆相关性判断（1）形态和