重组人干扰素α2b软膏(假单胞菌) (新增)

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1、重组人干扰素α2b软膏(假单胞菌)ChongzuRenGanraosuα2bRuangao(Jiadanbaojun)RecombinantHumanInterferonα2bOrintments(P.putida)本品系由高效表达人干扰素a2b基因的腐生型假单胞菌，经发酵、分离和高度纯化后，加入软膏基质制成。1.基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。2.制造2.1工程菌菌种2.1.1名称及来源重组人干扰素a2b工程菌株系由带有人干扰素a2b基因的重组质粒转化的腐生型假单胞菌菌株(PseudomonasputidaVG-4)。2.1.2种子批

2、的建立应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。2.1.3菌种检定主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。2.1.3.1划种LB琼脂平板应呈典型的腐生型假单胞菌集落形态，无其他杂菌生长。2.1.3.2染色镜检应呈棒状，可运动，有荚膜，无芽孢。涂片染色应呈典型的革兰阴性。2.1.3.3对抗生素的抗性应与原始菌种相符。2.1.3.4电镜检查（工作种子批可免作）应为典型的腐生型假单胞菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。2.1.3.5生化反应不液化明胶、不水解淀粉和聚β-羟基丁酸酯（附录ⅪⅤ），不能利用反硝化作用进行厌氧呼吸，能够合成荧光色素。应符合腐生型假单胞菌

3、生物学性状。2.1.3.6干扰素表达量在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。2.1.3.7表达的干扰素型别应用抗a2b型干扰素参考血清做中和试验，证明型别无误。2.1.3.8质粒检查该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。2.1.3.9目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。2.2原液2.2.1种子液制备将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养，供发酵罐接种用。2.2.2发酵用培养基采用适宜的不含任何抗生素的培养基。2.2.3种子液接种及发酵培养在灭菌培养基中接种适量种子液。在适宜的温度下进行发酵，应采用经批准的发酵工

4、艺，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（附录ⅨG）。2.2.4发酵液处理用高速离心法收集处理菌体。收集到的菌体可在-20℃以下保存，应不超过1年。2.2.5初步纯化采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。2.2.6高度纯化经初步纯化后，采用经批准的工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，即为干扰素原液。除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。2.2.7原液检定按3.1项进行。2.3软膏剂制备采用的基质应符合软膏剂基质要求（附录IG）。2.3.1配制按经批准的配方进行配制。2.3.2软膏制备按经批准的工艺进行

5、。软膏质地应均匀、细腻、涂展性良好，排除气泡。2.4成品2.4.1分批应符合“生物制品分批规程”规定。2.4.2规格应为经批准的规格。2.4.3包装应符合”生物制品包装规程”和附录ⅠG的规定。3.检定3.1原液检定3.1.1生物学活性依法测定（附录XC）。3.1.2蛋白质含量依法测定（附录VIB第二法）。3.1.3比活性为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于1.0×108IU。3.1.4纯度3.1.4.1电泳法依法测定（附录IVC）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于10μg(考马斯亮蓝R250染色法)或5μg(银染法)。经扫描

6、仪扫描，纯度应不低于95.0％。3.1.4.2高效液相色谱法依法测定（附录IIIB）。色谱柱以适合分离分子质量为5～60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0；上样量应不低于20mg，于波长280nm处检测，以干扰素色谱峰计算理论塔板数，应不低于1000。按面积归一化法计算，干扰素主峰面积应不低于总面积的95.0%。3.1.5分子量依法测定（附录IVC）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于1.0μg，分子质量应为19.2kD±1.92kD。3.1.6外源性DNA残留量每1支应不高

7、于10ng每1μg蛋白质应不高于2ng（附录IXB）。3.1.7宿主菌蛋白残留量应不高于总蛋白质的0.02%（附录IXD）。3.1.8残余抗生素活性依法测定（附录IXA），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。3.1.9等电点主区带应为5.7—6.7,供试品的等电点与对照品的等电点图谱一致（附录IVD）。3.1.10紫外光谱扫描用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约100μg/ml～500μg/ml，在光路1cm、波长230nm～360nm下进行扫描，最大吸收