基于可视化蛋白芯片的抗体分析方法研究

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1、基于可视化蛋白芯片的抗体分析方法研究作者：于辙,刘志红,吴英松,高建恩,孙启鸿,李明,印莉萍,许丹科【摘要】　　目的:建立一种基于蛋白芯片技术的抗体分析新方法。方法:将待分析的抗体制备成抗体芯片,并与生物素标记的抗原反应,然后经银增强法显色,获得可直接观察的微阵列芯片可视化反应结果。结果:实验中分析了10种18株抗体的活性和特异性的强弱,其中6株抗体具有较强的特异性。其中,ⅢC013、HPSⅡB007、HPSⅢB007分别对球蛋白和白蛋白的最低检测浓度可达0.4μg/L。结论:该方法具有通量化前景,且具有微量化、操作简便

2、快捷和结果可视化等特点。【关键词】抗体芯片银增强显色法抗体检测　　[Abstract]AIM:Toestablishanovelmethodforantibodyanalysisbasedonvisualproteinmicroarray.METHODS:Theantibodiesspottedonthealdehydemodifiedslideswereincubatedwithcorrespondingantigenslabeledbybiotin,followedbysilverenhancementdetect

3、ionmethod,andthechromogenicimageswerescannedbyCCDcamera.RESULTS:Theaffinityandspecificityofeachantibodywasassayedbythis9methodandsixantibodieswerefoundtohavehigherspecificitythantheothers.Adetectionlimitof0.4μg/LwasobtainedforantiglobulinⅢC013,antialbuminHPSⅡB0

4、07,andantialbuminHPSⅢB007.CONCLUSION:Thismethodissimple,fastandvisual.Inaddition,itneedslesssampleamountthantraditionalimmunoassayandhaspotentialtoachievehighthroughput.　　[Keywords]antibodyarray;silverenhancementdetection;antibodyassay　　抗体是蛋白质研究的重要工具之一,目前在抗体筛选中主

5、要是依赖于传统的ELISA方法[1-3]。近年来,在抗体筛选过程中已有引入蛋白芯片技术的报道,deWildt等[4]用带有抗体基因的高密度细菌阵列筛选重组抗体,何为等[5]制备抗体芯片筛选不同株的抗白蛋白、抗球蛋白,DeMasi[6]和Love[7]等在高通量的单克隆抗体（mAb）制备与筛选中引进了通量化的抗原芯片系统,进行克隆抗体的筛选。　　本研究中采用蛋白芯片技术并结合银增强检测方法,初步建立了基于抗体芯片技术的抗体活性和特异性的可视化分析,实验对10种18株抗体的活性和特异性强弱及检测限作了相应研究,获得了初步满意

6、的结果。9　　1材料和方法　　1.1材料八针手动芯片点样仪(VP478,美国V&PScientific公司),CCD芯片扫描仪（美国Photometrix公司）,微量透析器、透析器用超滤膜（1kD）（美国Sigma公司）,GenePixTMPro3.0芯片图象分析软件,醛基化玻片(美国CELAssociates公司),牛血清白蛋白（BSA）、生物素琥珀酰亚胺酯、胶体金标记链亲和素、银增强试剂A、B(美国Sigma公司),鼠IgG（华美生物工程公司）,10种抗原及18株抗体为南方医科大学生物技术学院和北京蛋白质组

7、研究中心抗体工程实验室提供,其他试剂为国产分析纯试剂。　　1.2方法　　1.2.1标记抗原抗原用PBS(pH7.4)稀释成0.5g/L,再与10g/L生物素琥珀酰亚胺酯室温条件下作用4h,1mol/LNH4Cl终止反应,将反应液加入微量透析器,PBS(pH7.4)缓冲液中透析过夜,得到的溶液-20℃条件下保存。　　1.2.2抗体芯片制备小型八针手动点样仪将抗体点到醛基化玻片,通过抗体上的氨基与玻片表面的醛基反应实现样品的固定。将待测抗体（10种18株）分别用PBS(pH7.4)稀释成0.5g/L,9同时鼠IgG与生物素

8、标记的鼠IgG分别作阴性与阳性对照,制备成抗体芯片,点样示意图见图1(A)。制备好的抗体芯片4℃条件下保存备用。　　1.2.3抗体芯片的反应与检测0.5mL/LTween20的PBS（pH7.4）缓冲液作洗液,清洗制备好的抗体芯片3次。加入10g/LBSA作封闭液,室温条件作用45min,用洗液清洗芯片3次。以1g/