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时间:2018-08-02
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1、卵巢肿瘤组织中nm23的表达和突变与其浸润转移的关系肿瘤1999年第4期第19卷医疗研究作者:李力 张洁清 赵仁峰 姚德生 唐步坚 何靖育 陈心秋 古明华单位:李力 张洁清 姚德生 唐步坚 陈心秋 古明华 广西医科大学附属肿瘤医院妇科(南宁530021);赵仁峰 何靖育 广西自治区人民医院妇产科关键词:卵巢肿瘤;基因表达;肿瘤转移;聚合酶链反应;基因,nm23 ??卵巢癌极易在早期发生浸润和转移,是导致初诊时70%已为晚期病人,60%的患者在首次手术时肿块直径超过10cm,并且有转移灶的重要原因[1]。nm2
2、3基因是近年来分离鉴定的一种与抑制肿瘤转移相关的基因[2]。为了探讨nm23基因的高表达与卵巢肿瘤浸润转移的关系,作者采用RNA聚合酶链反应(RT-PCR)以及多聚酶链反应-单链构象多态性分析技术(PCR-SSCP)对41例卵巢癌,20例卵巢良性肿瘤和21例正常对照组织中的nm23基因高表达以及突变进行检测。现将结果报告如下。? 材料与方法 一、研究对象全部标本均取自本科和广西自治区人民医院1996年3月~1997年5月住院患者的手术切除标本,并经病理学检查确诊。分为(1)卵巢恶性肿瘤组,共41例其中上皮性
3、肿瘤33例(粘液性癌10例,浆液性癌11例,内膜样癌2例,低分化腺癌10例),非上皮性肿瘤8例(内胚窦瘤3例,无性细胞瘤2例,颗粒细胞瘤,未成熟畸胎瘤,睾丸母细胞瘤各1例)。临床分期按FIGO标准(1988年),其中Ⅰ期12例,Ⅱ期4例,Ⅲ期22例,Ⅳ期3例。全部病例均接受手术加术后规则化疗,随访最短6个月,最长20个月,疗效评定按WHO四级评定标准[3]。(2)卵巢良性肿瘤组,共20例,其中粘液性瘤6例,浆液性瘤8例,良性畸胎瘤6例。(3)正常卵巢组,共21例均来自子宫肌瘤手术同时行卵巢切除,病理学检查正常者
4、。 二、组织标本收集及处理全部标本均在手术时收集,除一部分作常规组织病理学检查外,其余立即放入液氮中保存待检。恶性肿瘤除在原发灶取材外,其中23例同时在癌旁和转移灶取材。 三、nm23表达的检测方法1.组织总RNA的提取和cDNA的合成:组织中总RNA的提取采用酸性异硫氰酸胍一步法[4]。提取的总RNA加适量经二乙基焦酸盐(DEPC)处理的去离子水溶解,取其中10μl经1.0%琼脂糖电泳鉴定及紫外分光光度计定量,计算吸光度A260/A280比值,检测RNA纯度,比值均大于1.80。取1μg总RNA合成cDN
5、A。逆转录cDNA试剂盒由Promega公司提供,按说明书操作。2.PCR扩增:(1)寡核苷酸引物制备,引物的设计参考文献[5]。由中科院上海生物工程研究中心合成,具体序列如下: nm23-H1:5′-GCAGCCGCAGTTCAAACCTAA-3′ 3′-GCTGGGAGGAAGCATTTTAATCA-5′ nm23-H2:5′-CACCTTCATCGCCATCAAGCCG-3′ 3′-CCACCTCTTATTCATAGACACC-5′ nm23-H1及H2引物扩增DNA目的片段分别为685和475
6、bp。(2)PCR扩增反应:取4μl(100ng)反转录cDNA作PCR扩增,总反应体积20μl。含25mmol/LMgCl2;10×PCRBuffer;10mmol/LdNTPs;2uTaqDNA聚合酶;nm23-H1引物1.2pmol,nm23-H2引物0.7pmol。PCR扩增反应采用三阶温控法,nm23-H1为:94℃变性60s、56℃复性60s,72℃延伸90s,经33个循环后,72℃延长5min。nm23-H2:94℃变性60s,55℃复性60s,72℃延伸90s,经30个循环后,72℃延长5min
7、。(3)PCR产物电泳,采用非变性聚丙烯凝胶(PAG)电泳,方法参考文献[6]。3.PCR结果判断:PCR扩增产物经电泳分离后,以PCR-Marker分子量参照物(华美和物工程公司提供)对比碱基对大小。以出现明显的与目的基因碱基相同的区带(nm23-H1为685bp,nm23-H2为475bp)为阳性,见图1和2。图1nm23-H1基因RT-PCR结果1:为PCR-marker分子量;2:阴性对照;3:正常组 4,5:恶性肿瘤;6:良性肿瘤图2nm23-H2基因RT-PCR结果1:为PCR-marker分子量
8、;2:阴性对照;3,4:恶性肿瘤 5:良性肿瘤;6:正常组织 四、nm23突变的检测方法采用PCR-SSCP法,方法参考文献[6,7]。用0.1%硝酸银染胶,显带后立即拍照观察,见图3。图3nm23-H1基因PCR-SSCP银染结果?1:为PCR-marker分子量;2:正常对照; 3:恶性肿瘤;4:良性肿瘤; 五、统计学分析采用χ2检验进行率的比较。 结果 一、各组中nm
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