《细胞与分子免疫学杂志》蛋白c的检测方法及研究进展

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1、《细胞与分子免疫学杂志》蛋白C的检测方法及研究进展　　蛋白C是体内重要的抗凝血因子．其在体内的水平与年龄相关。多种因素可导致蛋白C缺乏。　　蛋白C缺乏症人群发病率为0．2％～0．5％．在血栓病患者中的发病率为5％～15％大部分蛋白C缺乏症无明显的临床症状。2％的蛋白C缺乏症有明显而严重的临床症状。严重的蛋白C缺乏症会使凝血与抗凝及纤溶系统发生紊乱．从而引发血栓性疾病，如深静脉血栓形成、弥散性血管内凝血等。也有报道称蛋白C缺乏与早期流产相关。目前蛋白C的检测主要有三种。一是检测蛋白C的含量；二是检测蛋

2、白C的功能：三是通过检测蛋白C基因PROC突变来诊断蛋白C缺乏本文主要对蛋白C的检测方法及应用的研究进展进行综述。　　1蛋白C的性质及功能蛋白C是维生素K依赖的血浆蛋白。它主要由肝脏合成．半寿期与凝血因子FVII相近．约为6h．比其它的维生素K依赖的凝血因子如F11、FIX、FX要短。丝氨酸蛋白酶激活蛋白C，使之成为活化的蛋白CfAPC1，APC与血管内皮上的内皮细胞蛋白C受体结合。活化蛋白C具有下列功能：　　f1)灭活凝血因子FVa和PVma。降解凝血活酶的形成速度．产生抗凝作用：APC对因子Va

3、和Ⅷa的灭活作用是迅速的，3g／ml的APC在3min内，可使80％因子FVa-,FNa灭活)APC能刺激内皮细胞释放tPA等纤溶酶原激活物．亦能灭活组织纤溶酶原活化抑制物(PA1)，参与促纤溶作用；(3)具酰基水解活性，对多种人工合成底物如S-2238、S一2366等起酰基水解作用。人体内血浆蛋白C含量有随年龄增长而增加的现象。每10年约增加4％嗍。　　2蛋白C基因(PROC)蛋白C基因位于染色体2q13-14．其基因序列共有10802个碱基．含有9个外显子（共1790bp)N8个内含子．而编码蛋

4、白C的外显子有8个。该基因的多种突变与蛋白C缺乏症相关．目前，报道其超过300种变异体．且目前没有发现明显的种族及地区的差异。遗传型的蛋白C缺乏症为常染色体的显性遗传．75％为单碱基的错义突变或者无义突变。少数为片段缺失或者插入突变。蛋白C缺乏有两种表现：一种是蛋白C含量降低，活性降低；而另一种为蛋白C含量正常，而活性降低。　　3通过血浆检测蛋白C缺乏的方法临床上蛋白C常用枸橼酸钠抗凝血进行检测．国际上首次制定蛋白C检测的标准品是在1988年。利用冻干的蛋白C作为标准品来校准各实验室的仪器。2006

5、年，国际生物制品标准品及质控品委员会(NIBSC)再次对蛋白C的标准品进行了校准。目前。蛋白C检测具有可溯源的校准品。　　早期对蛋白C功能的检测主要是通过与凝血酶或者血栓调节蛋白与凝血酶的复合物反应。然后通过凝固法或者显色底物法来检测活化的蛋白CfAPC1。但是此方法复杂且费用昂贵，随后很多实验室用免疫电泳法来检测。但是这种检测蛋白C抗原的方法不能分析其功能．不适用于蛋白C含量正常而功能下降的Ⅱ型蛋白C缺乏症的诊断。　　现在．蛋白C活性的检测大多通过商品试剂Protac~Protac~是单链的蛋白酶

6、．由铜斑蛇毒纯化提取的产物。Protac能够极其快速地激活蛋白C使之成为APC．可以有效地排除蛋白C抑制剂对试验的影响。凝固法的试验是基于APC灭活FVa、FⅧa，从而引起血液凝固时间的变化。通过标准曲线定量蛋白C。显色底物法是基于显色底物氨基酸的分解．而测定比色程度来实现的目前对于检测蛋白C缺乏的筛查比较推荐的方法是显色法．因为显色法干扰因素较少．且比凝固法准确川　　3．1凝固法检测蛋白C测定目标为蛋白C的抗凝活性，即对凝血因子FVa、FⅧa的灭活能力。本实验是一种基于活化部分凝血活酶时间(A唧，

7、首先将待检测的血浆蛋白C稀释．然后与缺乏蛋白C的血浆混合．加入APr丌试剂．最后加入Prota。Protac将蛋白C激活为APC。APC灭活FVa、FⅧa，最终使APTT延长．检测结果可从抗凝时间标准曲线中读出，以百分数表示。如FⅧ含量过量以及FVLeiden突变．可导致检测结果的假性偏低：如果被检测血浆中含有狼疮抗凝物质．则检测结果假性偏高。这些影响因素可通过显色底物法来排除，或者结合抗原含量的检测来综合评估对于FVLeidenn突变的样品．可行的方法是将样本与乏蛋白C血浆按照1：4混合．然后测定

8、混合物蛋白C的活性．但当蛋白C含量极低的时候．会降低混合血浆检测方法的灵敏度目前认为肝素含量低于1-2U／m1．不会影响凝固法的检测．但是当含有阿加曲班、水蛭素、比伐卢定等凝血酶抑制剂时．会使检测结果假性升高罔因此给予APTT的凝固法检测蛋白C活性的特异性不高一直是此方法的弊端。　　凝固法的第二种类型是基于Russell蛇毒凝固时间fRVV-X1，此方法不受高浓度的FVllI的影响f<1000U／ml1．且受到狼疮抗凝物质的影响也较小嘲凝固法检测蛋白C的活性是最