b、c基因型乙型肝炎病毒x蛋白对mdr1基因反式激活能力的比较

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1、B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白对MDR1基因反式激活能力的比较【摘要】目的研究B、C基因型乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对多药耐药基因1(MDR1)反式激活能力的差别。方法PCR扩增B、C基因型HBVX基因并克隆于pcDNA3.1/HisC载体(重组载体分别为pcDNA3.1/HisCXB及pcDNA3.1/HisCXC)。以FuGENE6将重组表达载体转染HepG2细胞,采用融合表达的Xpress多肽表位抗体,通过Westernblot检测目的蛋白在不同时间段的表达。PCR扩增MDR1基因启动子并克隆于萤火虫荧光素酶报告载体p

2、GL3Basic(重组载体为pGLMDR)。pGLMDR分别与pcDNA3.1/HisCXB或pcDNA3.1/HisCXC共转染HepG2细胞,转染后48h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性。实验数据以SPSS11.5软件分析。结果成功克隆X蛋白表达载体及MDR1报告载体。Westernblot显示pcDNA3.1/HisCXB或pcDNA3.1/HisCXC在HepG2细胞中均能表达HBVX蛋白,以转染后48h为最高。当pGLMDR报告质粒与X基因重组载体或空载体质量比在1∶2~1∶4范围内,萤火虫荧光素酶在各

3、转染细胞内的活性依次为pcDNA3.1/HisCXB+pGLMDR组>pcDNA3.1/HisCXC+pGLMDR组>pcDNA3.1/HisC+pGLMDR组(对照组),且存在剂量效应关系。结论B、C基因型HBVX蛋白对多药耐药基因均有反式激活能力,且B基因型强于C基因型。【关键词】肝炎病毒乙型癌肝细胞基因病毒11反式激活（遗传学）病毒蛋白质类基因MDR药物耐受性X蛋白是乙型肝炎病毒(HBV)最重要的致病因子之一,可反式激活多药耐药基因1(multidrugresisitancegene1,MDR1)[1]

4、,与HBV相关性原发性肝细胞癌(primaryhepatocellularcarcinoma,HCC)的高度恶性化及对化疗药物高度不敏感有关。研究表明B、C基因型HBV相关性HCC患者的临床表现及病理改变具有明显差别,而B、C基因型HBVX蛋白功能存在差异[24]。本研究拟通过分析B、C基因型HBVX蛋白对MDR1基因反式激活能力的差异,进一步探讨HBV基因型与致病性的相互关系。1材料和方法1.1材料1.1.1HBVDNA及肝细胞株pUC18XB(含B基因型HBVX基因的pUC18重组载体)及pUC18XC(含C基因型HBVX

5、基因的pUC18重组载体)为本室保存。HepG2肝癌细胞株(美国组织细胞库,ATCC)。1.1.2主要试剂DMEM培养基、DNAzol、胎牛血清、Westernbreeze试剂盒、AntiXpress抗体、pcDNA3.1/HisC(美国Invitrogen公司);ExpandHighFidelityPCRKit、FuGENE6(美国Roche公司);phRL11SV40,pGL3basic(美国Promega公司);质粒大量抽提试剂盒(美国Qiagen公司);Braford蛋白检测试剂盒(美国BioRad公司)。硝酸纤维素

6、膜(美国Amersham公司)。1.2方法1.2.1HBVX基因表达载体构建PCR扩增目的片段,所用引物为:上游(B基因)XbF:5’CGGGGTACCCAGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAAC3’(下划线为KpnI位点)上游(C基因)XcF:5’CGGGGTACCCAGCTGCTCGGGTGTGCTGCCAAC3’(下划线为KpnI位点)下游XbcR:5’GCTCTAGATTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC3’(下划线为XbaI位点)以pUC18XB为模板,引物XbF及XbcR用于扩增B基因型HBx(XB),

7、以pUC1811XC为模板,引物XcF及XbcR用于扩增C基因型HBx(XC)。扩增片段以XbaI及KpnI位点克隆于表达载体pcDNA3.1/HisC,经基因测序证实无误,所得克隆分别命名为pcDNA3.1/HisCXB(含B基因型HBx)和pcDNA3.1/HisCXC(含C基因型HBx)。1.2.2MDR1基因启动子报告载体构建以DNAzol抽提HepG2细胞染色体DNA,取0.2μg作为模板进行目的DNA扩增,引物设计根据参考文献[1],序列为:上游MDRB:5’CGAGCTCATCCTGCACTGTTTAGGGAGG

8、GTT3’(下划线为SacI位点)下游MDRP3:5’CTAGCTAGCTTTGAGCTTGGAAGAGCCGCTACT3’(下划线为NheI位点)以SacI、NheI位点克隆于pGL3Basic。重组载体以双酶切鉴定并经测序证实目