多重标记免疫组化技术在消化道肿瘤研究中的应用

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1、多重标记免疫组化技术在消化道肿瘤研究中的应用作者：鄂群，卫爱军，王艳煜，肖玉凤，陈怀生，钱铮，陈莉【摘要】目的：探讨消化道肿瘤病理标本切片三重标记免疫组化的方法。方法：采用非同源第一抗体Ki-67、Net-1和CD34，选用辣根过氧化物酶不同底物显色AEC和DAB，运用pH2.2甘氨酸-盐酸缓冲液作阻断剂，配合碱性磷酸酶检测系统作第一标记的方法分步进行免疫组化染色操作。结果：镜下观察在肿瘤组织中，Ki-67定位于细胞核呈蓝黑色，Net-1定位于细胞质呈棕黄色，CD34定位于血管内皮细胞。染色鲜艳，对比鲜明。结论：该法对于运用免疫组化方法研究原位显示3种抗原及其之间的关系具

2、有一定的实用价值。【关键词】多重标记免疫组化；阻断剂；吐温-20PBS；双重标记免疫组化试剂盒7多重标记免疫组化染色技术是根据特异性抗体与抗原具有高度特异性结合力的免疫学基本原理，以双重免疫组化染色技术为基础，在同一张组织切片上同时或先后标记3种以上的抗原，在原位显示不同抗原的毗邻关系及伴随状况的一种多重免疫组化染色法。本文探索了CD34、Net-1和Ki-673种抗原原位标记消化道肿瘤、胃癌和肝癌石蜡切片标本免疫组化的方法，为了解肿瘤组织及其细胞的细胞核、细胞质及其间质不同抗原出现、增加和消减或及其之间的分布规律提供了一种有效的技术手段[1]。1材料和方法1.1材料来源

3、胃癌80例标本取自江苏省南通市海门市人民医院和肝癌40例标本取自江苏省南通市肿瘤医院的存档蜡块标本，每例分别做Ki-67、Net-1、CD34免疫组化单染后，从中筛选出3种标记均为阳性的病例进一步做多重免疫组化染色。　1.2主要试剂（1）免疫组化双染试剂盒（Histostain-Dskit；CAT.NO:95-9999）为美国ZYMED公司产品；（2）二步法免疫组化检测盒(PowerVisionTMTwo-StepHistostainReagent；PV6002)、胰蛋白酶消化液（ZLI-9010）及免疫组化笔（ZLI-9305，PAPPen）和DAB显色剂（IL1-90

4、32；Lot:41281194）均为北京中杉金桥生物技术有限公司的产品；（3）阻断剂，pH2.2甘氨酸-盐酸缓冲液；（4）pH6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；（5）含0.05％吐温-20的PBS；（6）底物显色剂为DAB、AEC和BCIP/NBT；（7）即用型CEARMOUNTTM封固剂。1.3染色方法（1）石蜡切片，常规脱蜡至水；（2）将pH76.0柠檬酸缓冲液加热至沸腾，加入切片15分钟；（3）流水冲洗3分钟，用吸水纸将组织周围擦干，免疫组化笔画圈；（4）流水冲洗3分钟，蒸馏水冲洗浸泡2分钟×2次，每张切片滴加50μl3％H2O2去离子水，37℃孵育15分钟，以消除内源

5、性过氧化物酶活性；（5）流水冲洗3分钟，蒸馏水冲洗浸泡2分钟×2次，PBS冲洗浸泡2分钟×3次；（6）滴加胰蛋白酶消化液，37℃孵育10分钟；（7）流水冲洗3分钟，蒸馏水冲洗浸泡2分钟×2次；（8）PBS冲洗浸泡2分钟×3次，每张切片滴加50μl正常非免疫动物血清，37℃孵育15分钟，倾去血清，不洗；（9）每张切片滴加50μl第一重标记的第一抗体（小鼠抗Ki-67；1︰50），37℃孵育60分钟或4℃过夜；（10）0.05%吐温-20PBS冲洗3次，每次3分钟，甩去PBS液，每张切片滴加50μl广谱生物素化第二抗体37℃孵育30分钟；（11）0.05%吐温-20PBS冲洗

6、3次，每次3分钟；甩去PBS液，每张切片滴加50μl链霉卵白素碱磷酶轭合物，37℃孵育30分钟；（12）0.05%吐温-20PBS冲洗3次，每次3分钟；甩去PBS液，每张切片滴加50μl显色剂BCIP/NBT显色，显微镜下观察控制（肿瘤组织细胞核出现蓝黑色呈色反应为阳性）；（13）当显色反应强而背景染色弱或无时应中止反应；即用0.05%吐温-20PBS冲洗3次，每次3分钟；甩去PBS液，每张切片滴加增强剂50μl，37℃孵育30分钟;（14）按步骤（8）操作后，加第二重标记的第一抗体（兔抗Net-1；1︰400），37℃孵育40分钟；（15）按步骤（10）和（11）依次操

7、作；（16）0．05%吐温-20PBS冲洗3次，每次3分钟；甩去PBS液，滴加DAB显色液，每张切片滴加显色液50μ7l显色，显微镜下观察控制染色；（17）0.05%吐温-20PBS冲洗3次，每次2分钟；甩去PBS液，蒸馏水冲洗浸泡2分钟×2次；（18）滴加阻断剂1.5~2小时，解离双重标记免疫反应复合物[1]；蒸馏水冲洗浸泡2分钟×2次；（19）按步骤（8）操作后，加第三重标记的第一抗体（小鼠抗CD34；1︰100），37℃孵育60分钟；（20）0．05%吐温-20PBS冲洗3次，每次3分钟；甩去PBS液，每张切片滴加50μ