孕妇血中胎儿dna荧光定量pcr检测及与临产关系

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1、孕妇血中胎儿DNA荧光定量PCR检测及与临产关系【摘要】目的探讨晚孕期和临产后母血中胎儿DNA含量的变化及其临床意义。方法运用实时荧光定量PCR技术分别检测孕28～42周以及临产时孕妇血浆中胎儿DNA的含量并进行比较。结果孕28～31周、孕32～35周、孕36～42周和临产时的母血浆中胎儿DNA的平均含量比较差异有显著性(F=308.19,q=11.59～40.33,P<0.01)。结论随着孕期的进展，母血中胎儿DNA含量的升高可能是分娩的诱因之一。【关键词】孕妇；胎儿;DNA;聚合酶链反应　　［ABSTRACT］ObjectiveTostudythechangesofconten

2、toffetalDNAinmaternalplasmainlatepregnancyandinlabor,andexploretheirsignificance.MethodsThecontentoffetalDNAinmaternalplasmain28-42weeksofgestationandparturientperiodweredetectedbyusingrealtimequantitativePCRtechnique.ResultsThedifferencesofmeancontentoffetalDNAinmaternalplasmaamong28-31week,32

3、-35week,and36-42weekgestationandparturientperiodweresignificant(F=308.19,q=11.59－40.33,P<0.01).ConclusionWiththeprogressofdurationofpregnancy,thefetalDNAinmaternalbloodincreases,whichis,mostlikely,oneoftheinducementsleadingtodelivery.［KEYWORDS］Pregnant;Womenfetus;DNA;Polymerasechain8reaction

4、研究结果显示，孕妇血浆中存在胎儿DNA,且发现随着孕期的进展，胎儿DNA的含量也会相应升高[1]。但是对于母血中胎儿DNA含量的升高是否导致了临产的发生，它与临产及分娩是否有着密切的关系，文献报道较少。本研究旨在应用荧光定量PCR技术，检测母血中胎儿DNA含量的变化规律，从而在分子水平上探讨母血中胎儿DNA的变化及其与临产之间的关系。　　1对象与方法　　1.1对象2006年10月～2007年4月，选择在潍坊市人民医院产科就诊的正常孕育男胎的孕妇40例，分为28～31周组、32～35周组、36～42周组、临产组。正常临产是指孕妇孕龄36周以上，阴道少量见红，或伴有规律性子宫收缩，或见阴道流

5、水，不伴有任何妊娠并发症。对被研究对象进行定期随访，并征得病人的同意，等待产后确认胎儿的性别。同时，选取1例正常男性血浆和1例未孕、无妊娠史的女性血浆分别作为阳性和阴性对照。　　1.2方法　　1.2.1标本的准备　　取各组孕妇外周血3mL，用EDTA抗凝，12000r/min离心10min，取血浆放在灭菌离心管内，再次3000r/min离心10min，取上清于另一灭菌离心管中，-30℃保存。　　1.2.2血浆DNA的提取8　　采用Tiangen公司的微量DNA提取试剂盒，按照步骤及要求操作。所有步骤均由女性操作。　　1.2.3实时荧光定量PCR引物及探针的设计　　采用美国ABI公司生产的

6、Tagman荧光探针试剂盒，分别对Y染色体上的DYS14位点进行定量分析。DYS14片段大小为84bp,DYS14引物上游序列:5′GGGCCAATGTTGTATCCTTCTC3′；DYS14引物下游序列：5′GCCCATCGGTCACTTACACTTC3′；DYS14探针序列:5′TCTAGTGGAGAGGTGCTC3′。　　1.2.4实时荧光定量PCR检测　　标准曲线的建立和结果计算：按照10倍梯度稀释标准品，进行PCR扩增。各个梯度之间循环阈值(Ct)相差3～4个循环。然后，给每个梯度的标准品输入相应的拷贝数，以拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，建立标准曲线，从标准曲线

7、可以得出Ct值与拷贝数之间的转换关系，即利用待测标本的Ct值求出相应的DNA含量，此工作由AppliedBiosystems7500SequenceDetector所带SDS软件自动完成。实时定量PCR反应体系的建立和靶序列的扩增：反应体系总体积20μL，内含20×Primermix1μL，ddH2O7μL，DNA模板1μL，2×TagmanUniversalMasterMixture(ABI公司)10μL，荧光探针与引物1μL。采