二维毛细管电泳电化学检测尿样中的β阻断剂

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1、二维毛细管电泳电化学检测尿样中的β阻断剂【摘要】设计并制作了在柱电化学(EC)检测池，用于在同一根毛细管中进行中心切割二维毛细管电泳(2DCE)在线纯化分离检测尿样中的6种β阻断剂。尿样先在15mmol/LNaAc缓冲液中进行毛细管区带电泳(CZE)分离，带正电荷的β阻断剂与中性和带负电荷的干扰物质分成不同区带，然后在检测端施加13.8kPa压力将干扰成分从毛细管入口端排出，同时将目标组分驱送到毛细管入口端，最后在90mmol/LNaAc30mmol/LSDS缓冲液中进行胶束电动毛细管色谱(MEKC)分离。场放

2、大样品堆积(FASS)/胶束推扫在柱双重富集技术不仅有效抵消压力驱送过程中产生的区带扩散，还可进一步压缩样品区带，提高检测灵敏度。本方法成功用于服药后鼠尿样品中6种β阻断剂的分离测定，经第一维CZE分离排除干扰后，在未涂层毛细管柱(60cm×50μmi.d.)、90mmol/LNaAc/HAc30mmol/LSDS运行缓冲液、检测电位0.8V、运行电压10kV条件下，对6种β阻断剂进行在线富集分离，峰高、峰面积和迁移时间的相对标准偏差(RSD)分别为2.0%～4.1%，1.4%～3.7%和0.9%～2.7%(n=6

3、)。本研究为毛细管电泳在复杂样品在线纯化分析等方面的应用提供了新方法。【关键词】二维毛细管电泳;中心切割;电化学检测;β阻断剂11　1引言　　二维毛细管电泳(2DCE)是将分离机理不同而又互相独立的两个毛细管电泳分离模式以串联方式结合。Schoenherr等[1]制作了十字交叉型接口用于2DCE分离蛋白质及其水解物;Mohan等[2]用微透析接口连接毛细管等电聚焦(cIEF)瞬间等速电泳/CZE分离蛋白质混合物;Zhang等[3]用微注射器连接cIEF和毛细管电色谱分离蛋白质、肽及血浆样品;文献[4～7]制作了聚

4、砜中空纤维膜接口和蚀刻多孔膜接口，用于cIEFCZE[4,7]、cIEF毛细管凝胶电泳[5]和cIEF毛细管筛分电泳[6]分离蛋白质混合物。以上报道的2DCE均存二维切换接口处损失部分待测物[1]、第一维分离区带在接口处扩散[2～6]等缺陷。Cottet等[8]研究了在一根毛细管中进行2DCE分离，样品进行第一维分离后，用压力将感兴趣的组分驱送到毛细管入口端进行第二维分离，但在压力驱送过程中存在严重的区带扩散。为减小扩散，将毛细管内径减小到5μm[9]，但进样量非常小，只能采用高灵敏检测器，导致分离检测体系复杂

5、化。　　本研究制作了在柱EC检测池，用于在同一根毛细管中进行中心切割2DCE分离在柱EC检测尿样中的6种β阻断剂，并在第二维分离前采用FASS/胶束推扫双重富集技术压缩样品区带，不仅抵消了压力驱送过程中的区带扩散，还可使灵敏度提高4倍。11　　2实验部分　　2.1仪器与试剂　　MPIA型毛细管电泳仪(西安瑞迈分析仪器有限公司);石英毛细管(60cm×50μmi.d.，河北永年瑞沣色谱器件公司)。β阻断剂：盐酸烯丙洛尔、盐酸拉贝洛尔、马来酸噻吗洛尔、吲哚洛尔、阿替洛尔、纳多洛尔均为市售药物(青岛医保城)。十二烷基硫

6、酸钠(SDS)、冰醋酸、无水醋酸钠和乙腈(分析纯，上海化学试剂公司)。6种β阻断剂药物分别用水/乙腈(1∶1，V/V)溶解，用0.22μm滤膜抽滤后，分别配成1.00g/L的储备液，避光冷藏。实验用水为二次蒸馏水。　　2.2样品处理　　取大鼠2只，收集空白尿样5mL。6种药物均按30μg/g的剂量给药，2h后收集5mL尿样，加入1mL乙腈沉淀蛋白，涡旋混合2min，以4000r/min离心10min，过滤，冰箱保存，备用。　　2.3CEEC在柱检测装置11　　为进行在柱EC检测，参考文献[10]制作了蚀刻场隔离接头。

7、距毛细管出口端1.5cm处，用刀将毛细管一侧的聚酰亚胺涂层刮掉5mm，去掉涂层的部分毛细管放置在40%HF溶液中蚀刻3h形成一段多孔膜，在该处均匀涂敷一层醋酸纤维素浆，待凝固后，即形成只通过电流而无溶液泄漏的场隔离接头。其检测装置如图1所示。图1中心切割二维毛细管电泳在柱电化学检测装置　　Fig.1Schematicdiagramofheartcuttingtwodimensionalcapillaryelectrophoresis(2DCE)oncolumnECdetectionΦ20μmPt工作电极从毛细管出口端

8、插入0.5cm，与场隔离接头和分离毛细管呈直线。工作电极、Pt辅助电极、Ag/AgCl参比电极分别从3个不同位置插入聚四氟乙烯(PTFE)检测池中，将检测池置于PTFE密封池，并插入N2管。场隔离接头固定在缓冲液池中，并在池中插入Pt电极作为电泳接地电极。　　2.4实验方法　　毛细管在使用前依次用1mol/LHCl(